黄精组织培养与快速繁殖技术研究

邓少华，刘娟娟，陈丹凤，崔 强,2，肖稳运，张海霞,2

(1.郴州市林业科学研究所，湖南 郴州 423000；2.郴州市林下经济植物资源培育与利用技术研发中心，湖南 郴州 423000)

1 引言

黄精(Polygonatumcyrtonema) 又名“姜形黄精”，为百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum)多年生草本植物。自然分布于河南、安徽、浙江、江西、湖南和贵州等省，多生长于林下、灌丛或山坡阴处。黄精根茎既供药用，又可食用，以其干燥根茎入药[1～3]。现代研究表明，黄精富含多糖、皂苷、黄酮等化学成分[4～6]。黄精是传统药食两用的补益类药材，随着市场需求日益增长，野生资源过度采挖，加之生态环境的破坏，导致其野生资源日益枯竭，人工种植是解决其资源匮乏的重要途径之一[7]，而当前黄精繁殖方法主要有种子繁殖 (有性繁殖) 和根状茎分株繁殖 (无性繁殖)，种子繁殖存在收集难度大、发芽率低、育苗周期长和后代性状分化严重等问题[8]；根状茎繁殖存在繁殖率低和易积累病毒等缺点[9]，因此黄精的组培快繁研究极具意义，既丰富了繁殖方式，又满足了种苗供应。刘红美等[10]与李莺等[11]通过系统试验, 初步建立了黄精组培快繁技术。目前有关黄精的组织培养和快速繁殖研究主要集中在芽的分化诱导和生根培养等方面，而组培苗移栽种植过程中的问题也逐渐暴露，如成活率不高、出苗时间长等等。本试验以黄精带芽根茎为材料, 优化黄精组培快繁体系，以期为黄精工厂化育苗提供技术支持。

2 材料与方法

2.1 试验材料

采自湖南郴州境内原生地野生的自然生长发育的黄精根茎，将其用自封袋装好于4℃保存备用，用带芽根茎为组织培养的试验材料。该种野生黄精花期开白色花。

2.2 试验方法

2.2.1 外植体的选择与表面消毒条件的筛选

选取新鲜无病虫害的完整植株，剥去叶片，剪去下部须状根，用自来水反复清洗根茎。用解剖刀切取带芽根茎，用多菌灵水浸泡30 min 左右进行表面清洗，再置于流水下冲洗2 h，将预处理过的带芽根茎放在超净工作台上用 75% 酒精浸泡 20 s，用无菌水冲洗3～4 次，再用0.1% 的升汞HgCl2溶液分别消毒浸泡12、15、18 min，然后用无菌水冲洗5～6 次，滤去无菌水后用无菌滤纸吸干备用。再次剥去外包的叶片，保留基部包含生长点的幼芽，将里面的嫩芽接种到制备好的培养基上培养，每处理12瓶，重复3次，每瓶接1个芽，15 d后统计污染数和生长情况。

2.2.2 培养条件

培养基以MS为基本培养基，固定成分为蔗糖30 g，琼脂粉4.7 g，pH值5.8～6.0。培养室培养条件为室温23～25℃ ，光照强度为2 000lx左右，光照12 h/d。

2.2.3 芽诱导培养

以MS为基本培养基，将外植体接种于不同激素配比的培养基 M1 ～ M3 上(表1) ，共3个处理，每处理30瓶，每瓶3个芽。30 d 后统计结果。

表1 不同激素配比的芽诱导培养基

2.2.4 增殖、生根培养

将诱导出的芽转接到增殖培养基M4 ～M7上诱导增殖(表2)，共4个处理，每处理30瓶，每瓶接3个芽。30 d 后统计不定芽的增殖数及生长状况。

表2 不同激素配比的增殖生根培养基

2.2.5 炼苗与移栽

选取根数达3～4条，根长大于1 cm且长势良好的黄精组培苗120株进行炼苗。移栽前将组培苗在大棚室内炼苗7 d，前4 d紧闭瓶盖，后3 d逐渐松盖，提高抗性和适应性。将小苗根部的培养基清洗干净，移栽到黄心土∶泥炭土=1∶1的基质中，用0.1%的多菌灵溶液提前喷洒基质进行消毒，于温室中培养，适度遮荫，每隔2 d浇水一次，湿度保持在80%以上，待组培移栽苗新叶展开和新根长出后，即可按常规管理。90 d后统计成活率。

2.3 数据统计分析

各相关指标按如下公式计算：

污染率 = 污染个数/接种个数；

萌发率 = 萌发个数/接种个数；

增殖系数=增殖芽总数/接种外植体总数；

生根率 = 生根苗数/接种苗数。

3 结果与分析

3.1 消毒时间对外植体的影响

0.1%HgCl2溶液的消毒时间对黄精带芽茎根的影响结果见表3。试验结果表明：消毒时间短，萌发率高, 但污染较严重，外植体消毒时间长，污染率虽较低，但外植体出现白化死亡苗的现象。因此，HgCl2对黄精外植体消毒时间在15 min较适宜。在诱导培养基上生长15 d后，芽开始生长，基部明显膨大，27 d后开始分化出不定芽。

表3 不同消毒时间对外植体诱导存活影响

3.2 不同激素配比对黄精组培苗生长影响

通过不同成分配比培养基的试验比较，认真观察记录各个阶段黄精在培养基上生长表现状况，根据黄精组培苗在各个阶段不同培养基的生长表现状况，进行综合评价分析(表4)，表现好的用 “++++”表示，较好的用“+++”表示，一般的用 “++” 表示，相对较差的用 “+” 表示。

表4 黄精组培各阶段不同培养基表现情况

结果表明：在相同培养条件下，黄精带芽茎根诱导芽的成活率及长势对比可见M1>M2、M3，随6-BA浓度升高处理M3芽诱导率和多芽率也逐渐提高，但随着IBA浓度升高，且浓度为0.8 mg/L时会出现较多愈伤，不利于芽的诱导，说明在6-BA浓度1.0～2.0 mg/L和IBA浓度0.2～0.8 mg/L范围内，这2种外源激素共同作用下，浓度较低时更有利于芽的分化。

丛生芽在原瓶中能正常生长，但长势慢，将原茎根诱导产生的约2 cm 高丛生芽分别接种至不同增殖培养基中继代增殖，即可产生小苗。组培苗在不同处理培养基中长势M7>M5>M4、M6，6-BA浓度3.0 mg/L和花宝1号浓度1 g/L时对丛生芽增殖影响最大，平均增值系数为8.5，分化芽直接成苗，苗长势良好、健壮，叶片呈深绿色，且在接种45 d后可诱导生根，诱导出来的根多且长、较粗壮，植株生根率为100%，平均根数为16.8 ，平均根长为10.82 cm；但处理M4和M6中能分化芽直接成苗，但其组培苗易白化且生长缓慢，无根分化，此现象表明花宝1号对促进增殖生长的影响要强于NAA，由此可确定能够有效诱导黄精增殖的激素组合是6-BA 、IBA 和花宝1号。组培苗移栽后成活率达到了90%以上(图1)。

图1 黄精茎芽组培各阶段

4 结论与讨论

(1)植物组培快繁技术能有效的解决药用植物资源短缺的问题[12]。本研究以MS为基本培养基比较各阶段不同培养基诱导效果，与前人研究表明黄精属植物诱芽、增殖适用于MS培养基一致，而以1/2MS基本培养基培养黄精属组培苗生根与本研究结果不一致[13～17]。相较于周新华[9]建立的多花黄精组培生根技术，本研究选择的最优培养方法可将增殖和生根同时在同一培养基中培养，培养时间缩短45 d，且生根率高、根数多且长。

(2)不同的外源激素及不同的浓度对黄精组培各阶段的影响都不同，且在培养基内加入适当的有机添加物，能够增强培养物的生长、分化效应[18,19]。本研究诱导丛生芽形成的最适培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+ 0.2 mg/L NAA，最适合丛生芽增殖分化、生根的培养基为MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+1.0 g/L花宝1号，生根率达100%。试验中发现 6-BA 能显著增加黄精丛生芽的分化率，与徐忠传等[20]研究一致。李慧敏等[21]研究发现，添加花宝1号能促进白芨假鳞茎的诱导，本研究中适当添加花宝1号更有利于苗的生长，这可能与花宝1号培养基中的氮、磷、钾的配比更适合黄精丛生芽增殖和根的诱导。建议有条件时做更多的栽培基质及其配比试验，并增加供试株数，以探索更多更好地适合湘南地区黄精生长发育的栽培基质，为黄精栽培提供更为准确的试验结果。本研究建立的黄精组培快繁体系，为实现工厂化育苗提供了技术支持。