大脑中动脉闭塞大鼠不同缺血再灌注时间术后状况比较*

易婉莎，罗 来，许金森，潘晓华△

（1.福建中医药大学针灸学院，福建福州 350108；2.福建省中医药科学院，福建福州 350003；3.福建省经络感传重点实验室，福建福州 350003）

脑卒中，又称中风，是全球高致残率和高致死率的代表性疾病，由大脑中动脉或其分支的血管栓塞引起，其中缺血性脑卒中占绝大比例。我国卒中发病风险居全球首位，约40%的发病风险率意味着每5 人中2 人有罹患脑卒中风险[1]。2020 年，我国40 岁以上人群患脑卒中人数已达1780 万，死亡患者约为230 万，且相关数据呈上升趋势[2]。伴随老龄化社会的到来，我国脑卒中患病率并未得到缓解，脑卒中给患者及其家庭带来的经济负担、疾病负担仍在持续增加，对其展开相关研究已迫在眉睫。MCAO 模型是最接近人类缺血性中风模型，缺血再灌注是制备模型的重要步骤，再灌注时间少至15min[3]，多至24h[4]，未见统一标准。不同缺血再灌注时间对MCAO 大鼠术后状况是否产生不同影响，是制备MCAO 模型的重要考虑的因素。目前最常用缺血再灌注时间是1h、1.5h、2h[5]，三个时间点有一定间隔，如能确定最佳缺血再灌注时间将提高MCAO 模型制备效率。本研究分别以1h、1.5h、2h 为缺血再灌注时间制备MCAO 模型大鼠，通过对比各组大鼠的术后状况，寻找最适宜的缺血再灌注时间点，为MCAO模型制备提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF 级雄性SD 大鼠36 只，体重为（280±20）g，购自杭州医学院，饲养于福建省中医药科学院实验动物中心［许可证号：SCXK（浙）2019-0002；合格证编号：20211015Aazz0100000132］。饲养条件：温度（22±2）℃，湿度（55±15）%，12 h 明暗交替，自由进食饮水。饲养一周后随机分为3 组，每组12 只，拟制备缺血再灌注1 h、1.5 h、2 h MCAO模型大鼠，每组最终纳入实验数量以造模成功只数为准。

1.1.2 主要仪器与试剂 小动物呼吸麻醉系统（深圳瑞沃德生命科技公司，R407)、L3800号大鼠用MCAO线栓（广州佳灵生物技术有限公司）、自制平衡木、2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC，美国Sigma）、PBS 缓冲液（北京索莱宝公司）、通用型组织固定液（武汉塞维尔生物科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物模型制作与分组 本实验使用线栓法制备MCAO 模型[6]，①麻醉：使用小动物呼吸麻醉系统进行吸入式短效全身麻醉，经5%浓度异氟烷诱导3～5 min后进入麻醉昏迷，将其置于手术台上固定，浓度降至1.5%～2%维持麻醉。②分离动脉：剔除大鼠颈部毛发，消毒，剪开，钝器分离其颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。③插栓：自颈外动脉进栓，后转至颈内动脉，向左上45°缓缓插入，阻塞大脑中动脉分叉，感觉手下有阻塞感后停止。④缝合：进行切口缝合，停止麻醉，将大鼠放回笼中，注意保温，等待拔栓（模拟临床中风后自发再灌注现象）。⑤拔栓：各小组分别于切口缝合后1 h、1.5 h、2 h 进行麻醉，拔栓时缓慢轻柔，将线栓包被部分退至颈动脉分叉处，剪去多余线栓，随后放回笼中等待苏醒。

1.2.2 平衡木实验 将大鼠置于一根长30 cm，宽1.5 cm，平放在距离地面高30 cm 处的木条上，观察其稳定性及四肢状况进行评分，得分为0～6分，见表1。分数越高，神经损伤越严重。将36 只大鼠进行为期一周的术前适应训练，早晚各一次。造模后，将再灌注2 h 组、1.5 h 组、1 h 组大鼠分别于术后第1、3、7 天进行平衡木实验。

表1 平衡木得分表

1.2.3 Longa 五分法 待大鼠拔栓苏醒后采用改良Longa五分法神经功能评分判定造模成功与否，见表2。剔除0 分、4 分，1～3 分即为造模成功。再于大鼠造模后第1、7天进行神经功能评分。

表2 Longa五分法

1.2.4 造模成功率 比较三组大鼠造模成功情况，造模成功率=造模成功只数/总只数×100%。

1.2.5 体质量 造模成功后，记录大鼠术后第1、7天体质量。

1.2.6 TTC染色 造模7天后将大鼠处死，取其大脑置于-20 ℃冰箱冷冻2 h，后将脑组织置于切片模具中，由额部至枕部做冠状面切片，每片厚度约2 mm，取6片放入2%的TTC 溶液中，再放入37 ℃温箱避光染色，30 min 之后去除TTC 溶液，加入通用型组织固定液固定，24 h 后用相机拍照。使用Image.Pro Plus 6软件进行梗死体积计算，计算公式为：梗死体积率=梗死体积/（梗死体积+未梗死体积）×100%。

1.3 统计学分析 采用SPSS 27.0 软件进行数据分析。计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验。计量资料以均值±标准差（）表示，组内比较依据正态性检验结果，采用配对样本t检验或秩和检验；组间比较采用单因素方差分析，方差齐性采用Least Sig Difference 方法，方差不齐采用Dunnett′s T3方法，不符合正态性则采用多样本秩和检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 造模成功率比较 大鼠造模苏醒后采用Longa 五分法进行神经功能评分，评分标准见表2，1～3分表示造模成功，0、4分予以剔除。三组大鼠造模成功率差别不大，其中1 h 组出现Longa 评分为0 分大鼠2 只，1.5 h 组、2 h 组出现Longa 评分为4 分大鼠各三只。最终各组大鼠只数为：缺血再灌注1 h 组（n=10）、再灌注1.5 h组（n=9）、再灌注2 h组（n=9），1 h组造模成功率高于其他两组，但无明显差别，见表3。

表3 大鼠造模成功率

2.2 体质量 与第1 天相比，3 组大鼠体质量在第7 天均有所下降。其中，1.5 h 组与2 h 组大鼠第7 天体质量与第1天体质量相比差异显著（P＜0.05），见表4。

表4 大鼠体质量情况表（g，）

表4 大鼠体质量情况表（g，）

注：与同组第1天相比较，①P＜0.05

2.3 神经功能评分 采用Longa 五分法于造模成功后第1、7天对各组大鼠进行神经功能评分。第1天神经功能评分中3 组大鼠无明显差异，第7 天1.5 h 组、2 h组神经功能评分显著高于1 h 组（P＜0.05）；与第1 天相比，1.5 h 组、2 h 组大鼠第7 天神经功能评分增高明显（P＜0.05），1 h 组大鼠神经功能评分前后无明显差异，见表5。

表5 各组大鼠Longa 评分情况表（分，）

表5 各组大鼠Longa 评分情况表（分，）

注：与第1天比较，①P＜0.05；与1h组比较，②P＜0.05

2.4 平衡木实验评分3 组大鼠在术后第1 天平衡木评分无明显差异（P＞0.05）；1.5 h组、2 h组大鼠在术后第3、7天平衡木评分高于1 h组（P＜0.05）；1.5 h组、2 h组大鼠在术后第3、7天平衡木评分与同组第1天相比无明显差异；1 h 组大鼠在术后第7 天平衡木评分较第1天降低（P＜0.05），见表6。

表6 各组大鼠平衡木评分情况表（分，）

表6 各组大鼠平衡木评分情况表（分，）

注：与同组第1 天比较，①P＜0.05；与1h 组同一天比较，②P＜0.05

2.5 TTC 染色 如图为每组大鼠随机抽取1 只，每只6片相同脑组织切片的脑组织梗死对比图，经TTC 染色后3 组大鼠均可见不同体积的灰白色梗死灶，1 h组梗死灶多出现在皮质区，1.5 h组和2 h组在皮质区及基底核区均可见梗死灶，见图1；三组大鼠梗死体积随着时间的延长而增大；1.5 h 组、2 h 组大鼠梗死体积明显大于1 h组（P＜0.05），见表7。

图1 各组大鼠脑梗死对比图

表7 各组大鼠脑梗死体积率情况表（率，）

表7 各组大鼠脑梗死体积率情况表（率，）

注：与第1 h组比较，①P＜0.05

3 讨论

缺血性脑卒中占脑卒中绝大比例，是一种急性和严重的神经系统疾病，可导致严重残疾和死亡[7]。大脑缺血缺氧后一段时间血管再通引起更大程度的损伤，称为脑缺血再灌注损伤。缺血性脑卒中病理机制十分复杂，包括基因表达变化、氧化应激、离子失衡、炎症反应、血脑屏障功能障碍、线粒体功能障碍等多种病理过程，最终造成脑损伤和神经功能障碍[8]。临床表现为肢体麻木、共济失调、吞咽困难，甚至会有意识障碍、偏瘫、失语、昏迷等症状。在临床中还有一个不可忽视的现象，就是13%～43%中风患者会发生自发性再灌注，给患者带来更大损伤[9]。在动物实验方面，MCAO 模型是目前运用最为广泛的缺血性脑卒中模型，线栓法属最常用制备方法，MCAO 线栓制备模型通过阻塞大脑中动脉造成脑梗死，并通过拔栓造成缺血再灌注损伤，最大程度模拟缺血性中风患病过程。该模型导致大量梗死组织及功能障碍，有助于脑卒中的研究，如血脑屏障破坏、缺血的炎症反应、康复治疗等研究。但缺血再灌注时间的选择在现有研究中未见统一标准。如果不同缺血再灌注时间对MCAO 术后状况产生一定影响，缺血再灌注时间的选择将成为模型制备的又一考虑因素。

既往研究表明[10]，根据缺血时间不同，大鼠的梗死区域涉及纹状体、上覆的额顶叶和颞叶皮质，以及部分枕叶皮质，也会导致丘脑和下丘脑的梗死。早在2000 年，Zhang[11]等制造缺血30 min 和120 min MCAO 模型，分别诱导出轻症(基底核区)和重症(皮质加基底核区)的梗死，发现缺血面积可能和缺血时间有关。谭杰[12]等用MCAO 法制作缺血100min MCAO 模型，术后经MRI扫描也表现出皮质下基底核区梗死和皮质梗死两种类型。梗死体积会根据缺血时间不同而产生差别，梗死体积与缺血时间呈正相关是多数研究中的趋势[13]，但也有研究表明[14]，缺血时间超过1 h 对脑梗死体积影响无显著差异。本次实验中，3组大鼠脑梗死体积随着时间的的延长逐渐增加，缺血1 h后差异不明显；1.5 h组和2 h组大鼠梗死体积较大，梗死区域较广，1 h 组大鼠梗死体积较小，可能只涉及皮质梗死。

Longa 评分以0～5 分评价神经功能缺损状况，得分越高神经功能缺损越严重。在模型评判中，1 h 组2 只大鼠以无神经功能缺损剔除，1.5 h 组、2 h 组各3只皆以神经功能缺损严重剔除，提示1 h组大鼠整体神经功能缺损较轻。造模后第1 天，各组大鼠神经功能评分无明显差异；第7 天，1.5 h、2 h 组大鼠神经功能评分显著上升，且明显高于1 h 组，1 h 组评分无上升趋势，甚至评分下降，可能是1 h 组大鼠神经功能缺损较轻，不足以引起神经纤维损伤。

体质量是大鼠一般情况的重要指标，体质量变化能反映MCAO 大鼠的健康状况，脑缺血、手术过程都有可能造成大鼠体重下降，但主要因为大鼠术后受损严重，自发性进食减少。谭杰[12]等发现MCAO 后2 周内皮质梗死组大鼠的相对体质量明显小于皮质下梗死组大鼠，体质量下降的程度与脑缺血的严重程度有关。1 h组大鼠7天内体质量下降不明显，1.5 h 组与2 h 组大鼠均出现显著下降，原因可能为1 h 组大鼠受损较轻，MCAO 后已恢复，而1.5 h组、2 h 组大鼠缺血时间较长，脑组织受损严重，可能累及摄食中枢[15]。同样的现象也出现在平衡木评分中，平衡木功能评分能反应大鼠的运动功能及肢体协调能力[16]，1h 组大鼠平衡木功能评分在术后呈现下降趋势，提示运动功能、四肢协调能力得到改善；1.5 h组、2 h组术后平衡木功能评分差异不明显，提示运动功能、四肢协调能力恢复状况不佳。

娄惠娟[17]等利用光化学法和线栓法制备局灶性脑梗死大鼠模型，分析不同造模方法所致实验动物梗死体积与行为学之间的相关性，发现线栓法制备MCAO 模型梗死体积大小与行为学结果密切相关。谭杰[18]、张乾[19]等发现线栓法制备MCAO 模型会出现皮质下梗死与皮质梗死两种类型，大鼠行为学结果与梗死类型相关，皮质梗死与皮质下梗死大鼠相比体质量轻、行为学结果差。大鼠梗死体积与不同梗死类型均受缺血时间的影响。由此可知，不同缺血再灌注时间对大鼠术后状况存在一定影响。1 h组大鼠缺血时间短，梗死程度轻，存在一定自愈性，不适用于长期实验及康复治疗等研究；1.5 h、2 h 组大鼠术后各数据相似，梗死程度较重，可引起大鼠神经功能与运动功能障碍，且一周内无修复现象，更加适用于脑卒中各项研究。

综上所述，本研究通过观察1 h、1.5 h、2 h 缺血再灌注大鼠在术后7 天脑梗死体积、体质量、神经功能、平衡功能等状况发现1.5 h 组与2 h 组大鼠脑损伤程度较1 h 组高，符合MCAO 模型制备要求，1.5 h与2 h 更适合作为线栓法制备MCAO 模型的再灌注时间点。