上皮间质转化介导的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药机制及中医药治疗进展

杜怡曌,焦丽静,许 玲,徐建芳

(1. 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院,上海 200437;2. 同济大学附属上海市肺科医院,上海 200433)

肺癌是全世界肿瘤患者死亡的主要原因[1]。约85%的肺癌患者为非小细胞肺癌(NSCLC),其中表皮生长因子突变率为40%～80%[2]。目前表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)治疗已成为EGFR突变的NSCLC患者的一线治疗方法,但大多数患者会发生进展,这极大限制EGFR TKIs的获益[3]。上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)是一个上皮细胞通过某种特定程序转化为具有间质表型细胞的动态过程。在此过程中,上皮细胞顶端-基底极性和完整的细胞-细胞连接丧失,同时获得前后极性和细胞骨架的显著重塑。其标志物表达下调,如N-Cadherin、E-Cadherin,而Vimentin、纤连蛋白等间质标志物表达上调,并且细胞具有更强的侵袭能力、治疗抵抗力和癌症干细胞样特性[4]。近十年来相关研究指出EMT与耐药之间存在联系,如HCC827 细胞的吉非替尼耐药亚系显示出与EMT一致的表型和分子变化[5];对吉非替尼和奥希替尼各产生获得性耐药的NSCLC细胞HCC827和H1975没有EGFR继发突变,却表现出EMT特征[6]等。中医药作为一种有效的辅助治疗手段被多项研究证明可以通过多种途径抑制或逆转EMT,从而达到延缓EGFR-TKIs耐药发生的目的,提高患者生存率。因此进一步了解EMT介导耐药的机制基础,深入探究传统中医药与EMT现代药理之间错综复杂的关联,有助于提高NSCLC患者TKI治疗的效益,可为NSCLC治疗提供有前景的策略。

1 EMT在EGFR-TKIs耐药中的作用

1.1钙黏附蛋白E(E-cadherin) E-cadherin是一种钙依赖性的跨膜蛋白,它分布于人和动物的各类上皮细胞,参与细胞间黏附,在维持细胞的极性和完整性等方面起重要的作用。E-cadherin的表达与EGFR-TKI分子靶向治疗敏感性有密切关系。研究发现对EGFR-TKIs高度敏感的NSCLC细胞株Calu3会表达E-cadherin,而耐药株H157则不表达E-cadherin[7]。加权线性加和(76-gene EMT signature)表明,EMT信号与E-cadherin蛋白水平显著正相关;根据EMT信号分类为间充质的细胞对厄洛替尼也更具耐药性[8]。EGFR和E-cadherin的亚细胞定位非常相似,都存在于细胞间黏附的带状带中[9]。早期免疫实验表明,在细胞黏附连接的过程中,E-cadherin与EGFR共同聚集,通过物理作用,直接协同激活下游信号通路,从而导致Shc的磷酸化和MAPK酶活性的增加。最近的研究表明,E-cadherin作为信号转导分子,其黏附连接的组装可以触发上皮细胞中PI3K/Akt的激活。其介导的钙依赖黏附连接的形成诱导EGFR的配体非依赖性激活和MAPK的激活状态迅速增加,这一过程可以被EGFR-TKI完全抑制[7]。由此看出,E-cadherins可以通过与EGFR的结合来启动由外向内的信号转导通路。而有关研究观察到上皮细胞系(EGFR突变型和野生型)相较于间充质系有明显更广的EGFR通路激活[8]。虽然EGFR野生型患者的激活机制尚不清楚,但上皮型NSCLC中EGFR通路激活的频率较高可能是其对厄洛替尼更敏感的原因。此外,相关研究还报道了E-cadherin可以负调控不同类型受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTKs)的配体依赖激活,降低受体流动性和配体结合亲和力[9]。因此,间充质细胞中E-cadherin的减少可能降低了其生长对EGFR信号通路的依赖,从而降低EGFR-TKIs的敏感性。

1.2EMT相关酪氨酸激酶(RTK)轴 EMT可通过激活下游通路降低细胞对EGFR-TKIs的敏感性。AXL是Tyro3-AXL-Mer(TAM)受体RTK的成员,其高表达常与耐药性相关,它也是NSCLC[8]中EMT基因表达特征的一部分。与EMT相关的两个转录因子复合体(YAP1和TAZ)可以调控AXL的表达。在Kras驱动的小鼠肺癌模型中,YAP1被证实参与调节EMT的转录程序[10];在上皮细胞中,TAZ与细胞极性决定簇Scribble相互抑制,EMT通过破坏这种联系可以激活TAZ-TEAD[11]。这两个旁系同源蛋白与TEAD1-4转录因子相互作用,共同被招募到AXL基因启动子。此外,YAP1与ZEB1物理上相互作用,可以占据AXL基因启动子并刺激转录[12]。同时,AXL基因是Fos相关抗原1(Fos-related antigen1,Fra-1)[13]的直接靶点,在乳腺癌[14]的EMT过程和耐药性中,Fra-1是调节EMT的关键因子。对乳腺癌细胞中YAP/TAZ-TEAD和AP-1转录组的全基因组分析揭示了这些复合体与驱动侵袭和生长的基因增强子存在物理联系[15]。AXL通过多种机制激活细胞生存途径,帮助NSCLC细胞逃避EGFR靶向治疗:AXL的活化可调控 PI3K/AKT1/Rac1通路和细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)信号通路,从而促进NSCLC细胞的迁移、侵袭以及增殖,使其对EGFR-TKIs产生耐药性[16]。AXL可引起NF-κB的早期磷酸化,并激活下游 PI3K/AKT通路,从而上调抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的表达,抑制促凋亡蛋白caspase 3的表达,从而促进细胞存活[17]。实验数据表明,AXL的激活确实可以导致NSCLC细胞对第一代EGFR-TKI产生耐药性。当AXL过表达或者上调其配体Gas6时,会发现AXL的激活与厄洛替尼耐药肿瘤样本中的EMT特征相关,AXL抑制剂可以恢复厄洛替尼耐药细胞株和移植瘤对厄洛替尼的敏感性[18]。这些数据支持EMT可能在由AXL驱动的EGFR-TKIs获得性耐药的形成过程中发挥作用。另有研究表明,间质表型细胞不仅产生持续的AXL激活,还可以显著提高对PI3K/AKT信号通路抑制剂的抵抗,引发非EGFR依赖性PI3K/Akt信号通路激活,从而导致肿瘤细胞对厄洛替尼等EGFR-TKIs治疗的不敏感,再次佐证间充质细胞可能减少了对EGFR家族RTK信号和下游信号通路的依赖[8]。AXL不仅是EMT的下游效应器,它已被证明可以驱动EMT程序并维持间充质状态。在乳腺上皮细胞中,AXL的异位表达诱导了EMT,AXL抑制剂逆转了间充质乳腺癌细胞的表型[19]。同样,沉默间充质亚型卵巢癌细胞中的AXL逆转了它们的形态和上皮标志物的激活表达,表明AXL在保护癌细胞间充质状态方面具有共同作用[20]。

1.3免疫逃逸 通过激活免疫抑制检查点逃避免疫监测是癌症的标志之一[21]。T淋巴细胞表面的程序性死亡受体1(PD-1)与其配体 PD-L1结合可促进肿瘤浸润T淋巴细胞向调节性T细胞分化以及导致T细胞耗尽,促使肿瘤细胞逃避免疫系统监视和杀伤[22]。PD-L1 高表达可能是EGFR-TKIs原发性耐药机制之一。Hsu等[23]报道发现,EGFR突变且对EGFR-TKIs原发性耐药的NSCLC患者的PD-L1阳性率显著高于对照组(45.5% vs 12.3%,P<0.05),而且使用EGFR-TKI治疗的PD-L1阳性患者的中位生存期和无进展生存期显著短于PD-L1阴性患者(11.2 vs 38.2 个月;2.1 vs 7.3个月,P<0.05)。其机制可能是PD-L1引起YAP1上调[24],或通过 TGF-β/Smad诱导EMT,导致NSCLC细胞对吉非替尼产生耐药[25]。相关文献表明,EMT可能导致肿瘤细胞的免疫逃逸,从而导致对EGFR-TKIs的耐药性。间质评分高的肺腺癌中PD-L1基因表达明显上调[26]。对PD-L1基因调控的分析证明,PD-L1在NSCLC细胞中是miR-200家族的直接靶点[27],在乳腺癌中受miR-200/ZEB1轴的调控[28]。因此,ZEB1在NSCLC细胞中的表达可能以PD-L1依赖的方式调节浸润性CD8+T细胞的功能,同时增强NSCLC细胞对干扰素-γ(可驱动PD-L1)的反应[27]。除了PD-1/PD-L1通路外,在表现为EMT表型的肺腺癌中还检测到多种靶向免疫检查点分子的升高[26]。这些数据表明,EMT通过与PD-L1的相互作用,可能导致肺癌细胞对EGFR-TKIs的耐药。

1.4其他 除上述机制外,EMT还可以通过激活ABC(ATP binding cassette,ATP结合盒)转运蛋白获得耐药性。由于ABC转运蛋白增加药物外排的特性,导致细胞质内药物密度降低,故研究发现ABCG2(ABCG亚家族成员2)转导的细胞对吉非替尼具有耐药性[29]。这与MiRNA的调控相关,如miR200可以直接靶向ZEB1和ZEB2的3‘-UTR区域,而在EGFR-TKI耐药的NSCLC细胞系中检测到ABC转运蛋白ABCB1的表达增强,并表现出CSC/间充质特征和miR-200的表观遗传沉默[30]。此外,表观遗传等[31]复杂调控也是EMT导致EGFR-TKIs耐药的原因。

2 中药抑制EMT克服EGFR-TKIs耐药的研究

2.1中药单体

2.1.1紫草素 紫草素(shikonin)是从草本植物紫草中提取的一种萘醌类化合物,具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等生物活性作用[32]。路京等[33]研究发现肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)诱导人肺癌HCC827细胞发生EMT,在加入紫草素干预后,则可逆转HCC827细胞 E-cadherin蛋白表达下调和Vimentin蛋白表达的上调,恢复HCC827细胞对吉非替尼的敏感性,提示紫草素可能通过抑制EMT逆转了细胞对吉非替尼的耐药。这与紫草素可抑制HGF诱导的HCC827肺癌细胞中Akt和ERK的磷酸化[34],调控PI3K/Akt和MEK/ERK信号通路,从而抑制HGF/c-Met介导的EMT相关。可见,紫草素通过参与调控EMT相关RTK轴,抑制了吉非替尼耐药。

2.1.2氧化苦参碱 氧化苦参碱(oxymatrine)是中药苦参重要成分之一,它可以通过影响细胞骨架结构抑制EMT 的发生。实验观察表明,当氧化苦参碱的剂量由0.5 mM升高为 1 mM时,非小细胞肺癌A549细胞Vimentin的结构由遍布细胞的网状结构转变为出现在部分细胞细胞核附近的点状结构,伴有Vimentin荧光强度下降及E-cadherin的表达水平升高[35]。沈云飞等[36]通过苦参对人肺腺癌耐吉非替尼 PC9/ZD细胞株的逆转研究发现,苦参联合吉非替尼能够明显抑制细胞侵袭能力,并提高耐药细胞对吉非替尼的敏感性,诱导PC9/ZD 细胞Vimentin、N-cadherin蛋白表达下调,E-cadherin表达上调,调控EMT,从而逆转EGFR-TKIs的耐药。由此推断,苦参通过参与细胞骨架重建,提高E-cadherin水平,抑制EMT,从而逆转靶向耐药。但是该实验中研究者选用材料为复方苦参液,其中涉及苦参的具体成分尚不明确,在此过程中是否受到其他成分影响有待进一步研究。

2.1.3重楼皂苷I 重楼(rhizoma Paridis) 是百合科重楼或七叶一枝花的根茎,主要化学成分为甾体皂苷[37]。重楼皂苷I (polyphyllin I) 可以抑制NSCLC细胞株PC9和A549 的NF-κB亚基p65蛋白磷酸化及其下游靶基因如Bcl-2的表达[38-39]。NF-κB可以与IL-6基因的启动子相结合,与其他转录因子协同作用于IL-6启动子,促进IL-6的表达[40]。这解释了Lou等[41]通过体外实验发现重楼皂苷I通过抑制IL-6/STAT3信号通路,逆转厄洛替尼获得性耐药肺腺癌细胞株HCC827的EMT过程,有效恢复其药物敏感性这一事实。结合以上研究,合理推断重楼皂苷I通过抑制NF-κB途径减少IL-6的产生,参与调控AXL与EMT的平衡,进而恢复耐药细胞的药物敏感性。

2.1.4黄芪多糖 黄芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)是黄芪干燥根茎提取出的一种水溶性成分,也是中药黄芪发挥作用的主要成分,具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤等生物学性[42]。Wei等[43]利用TGF-β1诱导肺腺癌细胞株PC9发生EMT,产生GR细胞。通过对PD-L1/SREBP-1途径进行基因敲除,可抑制GR细胞增殖能力,同时E-cadherin表达水平增加,Vimentin表达水平降低。表明APS可以通过PD-L1/SREBP-1/EMT信号通路逆转GR细胞的耐药性,再次证实EMT通过与PD-L1的相互作用,可能导致肺腺癌细胞的EGFR-TKIs耐药性。

2.1.5木犀草素 木犀草素(luteolin)是一种天然黄酮类化合物,广泛存在于夏枯草、菊花、金银花等中药中。实验证明木犀草素可逆转TGF-β1诱导的肺癌A549细胞EMT,其机制是抑制PI3K/Akt磷酸化,降低NF-κB的表达,减少与E-cadherin上游转录调控因子之一的Snail结合,增加E-cadherin的产生[44]。另外,王佶[45]研究发现,对于TGF-β1诱导的吉非替尼耐药非小细胞肺癌PC-9/GR细胞,木犀草素联合吉非替尼比单用吉非替尼对PC-9/GR细胞活力有更明显的抑制作用,伴有E-cadherin表达上调,提示木犀草素能够逆转PC-9/GR细胞的EMT,进而恢复对吉非替尼的敏感性。可见,木犀草素逆转吉非替尼耐药与其可调控EMT-AXL轴密切相关。

2.1.6姜黄素 姜黄素(curcumin,CUR)来源于姜科姜黄属植物姜黄,是一种多酚类活性成分,能够阻断上皮细胞发生EMT,对肺癌具有抗肿瘤侵袭和转移的作用[46]。詹建伟等[47]报道HGF可诱导NSCLC 细胞PC9发生EMT,同时使c-MET/Akt/mTOR磷酸化水平增加,降低PC9细胞对吉非替尼的敏感性。单独使用吉非替尼处理,并不能逆转 PC9 细胞的EMT;而姜黄素与吉非替尼双药联用则实现了PC9细胞E-cadherin蛋白表达上调,并阻断HGF诱导的c-Met/AKT/m TOR磷酸化,提高PC9细胞对吉非替尼的敏感性,证实姜黄素可以通过逆转PC9细胞EMT逆转该细胞对吉非替尼的耐药性。该过程可能是姜黄素通过调节c-Met/PI3K/Akt/mTOR通路,从而抑制EMT实现的[48]。

2.1.7小檗碱 郑芳[49]针对小檗碱(berberine)联合吉非替尼抑制NSCLC A549和H1975细胞增殖及EMT进行研究,发现小檗碱通过调控LncRNA HOTAIR/miR-34a-5p/Snai1信号通路,诱导E-cadherin蛋白表达增加,协同抑制NSCLC细胞EMT的发生,影响肿瘤细胞的侵袭和转移,从而增加NSCLC细胞对EGFR-TKI靶向治疗敏感性。其机制是小檗碱可以抑制HOTAIR表达,后者作为一种具有致癌作用的竞争性内源RNA(CERNA),通过吸附miR-34a-5p直接靶向调控EMT转录因子Snai1的表达,抑制EMT过程。

2.2中药复方

2.2.1除痰解毒方 除痰解毒方是李荣亨教授40多年从大量临床实践中总结出来的治疗肺癌的有效方剂,全方标本兼顾,具有除痰解毒抗肿瘤之功效。罗杨等[50]研究发现,除痰解毒方联合吉非替尼对人肺腺癌耐药细胞株H1975细胞生长的抑制作用比单用吉非替尼更明显,同时可以不同程度地上调E-cadherin蛋白及mRNA的表达,下调Snail和Vimentin蛋白及mRNA的表达,提示除痰解毒方通过EMT途径逆转吉非替尼耐药,其机制可能与增加E-cadherin的表达,避免非EGFR依赖性信号通路的激活,从而恢复肺癌细胞对EGFR-TKIs的药物敏感性有关。

2.2.2肺岩宁方 肺岩宁方是徐振晔教授多年来治疗肺癌的经验方,具有益气养精、散结解毒的功效,在改善患者症状及机体功能方面具有显著效果。康小红等[51]针对肺岩宁方联合吉非替尼或厄洛替尼治疗晚期肺腺癌患者(Ⅲb期或Ⅳ期)进行了回顾性分析,近期临床疗效与单纯靶向治疗相当,但中位疾病进展时间(TTP)明显优于靶向治疗组(12.0个月 vs 9.5个月,P=0.042)。其机制可能与肺岩宁方通过下调EMT核心转录因子Fibronectin和N-cadherin相关[52]。

2.2.3扶正抗癌方 扶正抗癌方是经过多年临床实践验证的肺癌拟定方,具有扶正祛邪、清热解毒、化痰祛瘀抑瘤的功效。杨小兵等[53]实验证明扶正抗癌方可通过下调EGFR及其下游的Akt、ERK、STAT3通路逆转A549和H1650细胞对吉非替尼的耐药,达到抑制肺癌细胞增殖的目的。这个过程涉及扶正抗癌方可通过抑制STAT3-MMP9通路,剂量依赖性地下调N-cadherin和Vimentin蛋白的表达而逆转EMT[54]。可见,扶正抗癌方对肺癌细胞EMT的抑制是扶正抗癌方逆转肺癌细胞耐药的潜在机制之一。

3 小 结

EMT是导致EGFR-TKIs获得性耐药的重要机制之一,已有众多针对其开发的新药,如IGF-1R通路调节剂AXL1717,YAP/TAZ-TEAD-AXL-GAS6 通路抑制剂、ABCG2转运蛋白抑制剂Ko143、STAT3特异性抑制剂OPB51602等。但以上新药大多处于Ⅰ期临床试验,存在半衰期较长、耐受性较差、不良反应较多等问题。

传统医学认为,肿瘤发生发展的关键在于正气亏虚, 邪气入侵, 痰毒凝聚, 因虚致实,治疗上当遵循扶正祛邪、益气养精、化痰散结等治则,多选用具备清热活血、解毒散结、化痰祛湿、理气健脾等多重功效的中药,复方配伍也注重益气养阴,祛邪兼顾人体正气;清热不离解毒,祛痰不舍化瘀。中药配合EGFR-TKIs,可增强其疗效,改善患者临床症状和体征,延长生存时间,减轻毒副作用,防止肿瘤的复发和转移,稳定肿瘤的进展,让肿瘤和机体和平共处,实现“带瘤生存”。因其优势,中医药越来越得到世界范围内的认可,只是目前仍存在一些未解决的问题:①某种中药通过EMT途径延缓靶向药物耐药的同时,是否还通过其他途径联合达到逆转耐药的效果?②现有许多研究发现某些中药可以抑制或逆转肺癌细胞EMT过程,但并未进一步求证其是否可以逆转靶向药物耐药。③目前EMT通过何种分子机制参与NSCLC发生EGFR-TKIs获得性耐药仍不明确。④尚且缺少中药逆转靶向药物耐药的大型临床试验或RCT试验,需要积累更多的临床经验,兼顾临床疗效、不良反应等。以上种种都可以作为日后研究及试验的切入点,成为探讨通过EMT逆转EGFR-TKIs耐药性的关键环节。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。