慢病毒载体在β地中海贫血基因治疗中的研究进展

刘译泽，镡 颖，2，朱宝生，2*

1.昆明理工大学 医学院，云南 昆明 650500；2.云南省第一人民医院 昆明理工大学附属医院 医学遗传科，云南 昆明 650032

β地中海贫血(β地贫)是由β珠蛋白(β-he-moglobin,HBB)基因突变引起的溶血性贫血病,而且也是全球最常见的单基因遗传血液病。治疗β地贫的主要思路是将基因治疗与自体造血干细胞移植相结合,纠正贫血表型和抑制无效的红细胞生成。利用慢病毒载体(lentivirus vector, LVV)将具有完整功能的β-珠蛋白(β-hemoglobin,HBB)基因体外整合入自体造血干细胞再回输,以纠正β珠蛋白合成障碍,或利用慢病毒介导的基因编辑技术原位修复HBB基因, 是β地贫基因治疗的两大 主要策略。本文将对近年来LVV介导的β地贫基因治疗研究进展做一综述。

1 慢病毒载体概述

1.1 慢病毒载体的一般结构及优化

慢病毒为双链RNA病毒,具有反转录和整合功能。当前临床研究使用的LVV主要是从人类免疫缺陷病毒-1(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)人工改造而来[1]。慢病毒载体系统由包装成分和载体成分构成。包装成分提供产生病毒颗粒所必需的蛋白,载体成分提供含有包装、反转录和整合所需的HIV顺式作用序列。为了提高生物安全性,LVV经历了一代又一代的更新。相较于第一代LVV表达系统,目前常用的第三代LVV表达系统删除了4个辅助基因、原有的增强子以及转录因子结合部位,提高了LVV的滴度和生物安全性[2]。

1.2 慢病毒载体的功能及优势

LVV可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达目的序列的效果[3]。与其他基因转移载体相比,LVV有几个优点:1)LVV可以不可逆转地整合到宿主基因组中,从而可以使其在细胞分裂时保持转基因的持续表达;2)LVV有相对较大的有效载荷;3)由于缺乏所有病毒编码基因,LVV引发免疫缺陷病的几率较低;4)LVV可被广泛地改造以提高生物安全性;5)LVV可以用在大量异源包膜糖蛋白的病毒假型包装中。

2 基因整合策略

LVV介导的基因整合策略是通过LVV将具有完整功能的HBB基因整合至造血干细胞的基因组中,使基因整合后的造血干细胞及其复制生成的子代细胞产生正常的血红蛋白[4]。目前的研究进展主要为提高LVV的滴度、转导效率以及推进临床实验。由于造血干细胞难以获取,且在分离、培养、转导、检测和植入等过程中易发生细胞的损失;细胞毒性与基因毒性的降低依赖于细胞转导过程中更少的病毒颗粒。因此提高慢病毒滴度以及载体拷贝数(vector copy number, VCN)极为重要[5]。目前提高滴度及VCN的方式主要有以下两种:优化LVV结构和添加相关增效因子。

2.1 LVV结构优化

缩短LVV的基因组长度及优化相关元件可以有效提高VCN[6]。由于LVV的滴度和转导效率与病毒基因组长度成反比[7],通过只保留有效的基因座控制区(local control region, LCR)元件,进而缩短LVV的长度是载体优化的重要手段。另一方面,在优化长度的同时,将LVV内源性RSV启动子替换为CMV启动子,HBB的表达将提高两倍[8],同时由于内源性启动子的替换,LVV恢复野生型的概率也会大大降低,提高了其生物安全性。以上两种方案是LVV结构优化上的主要研究方向。

2.2 添加相关增效因子

添加相关增效因子也是提高VCN的有效方法。一方面,使用转导增强剂可以显著提高LVV对造血干细胞的转导效率。通过加入转导增强剂可以使目的基因的表达量及VCN增加3～6倍[9],已经进入临床试验的LentiBOOST载体在进行转导实验中加入的转导增强剂:硫酸鱼精蛋白(protamine sulfate),对转导效率的提高最为明显,总VCN提高了6倍以上。另一方面,白藜芦醇三聚体也是一种增强转导效率的因子。环状白藜芦醇三聚体A(cyclic resveratrol trimer caraphenol A)可以通过抑制人体对LVV的抗毒性,减少LVV在人体内的被抑制,进而增强LVV对造血干细胞的转导效率[10]。

2.3 临床研究进展

BB305载体去除了LCR的HS4区域来增加载体的稳定性和滴度,同时整合了CMV启动子来驱动载体在细胞中的转录。在使用Beti-cel基因疗法治疗β-地贫临床研究中,经BB305载体转导的自体CD34+干细胞被注射到经白消安清除过骨髓细胞的患者体内。在22例患者中,20例脱离了输血依赖,其中6例的年龄在12岁以下。在输血期间,患者体内的平均血红蛋白水平为11.7 g/dL (范围为9.5～12.8 g/dL)。 在输注Beti-cel 12个月后,用T87Q氨基酸替代法测定基因治疗对患者体内成人型血红蛋白(HbA)水平的影响,其中位数为8.7 g/dL (范围为5.2～10.6 g/dL)。其中4例患者均有与Beti-cel相关的不良反应,但这些不良反应均不严重[11]。另一项临床试验中,在对患者使用BB305载体进行体外转导自体CD34+细胞的基因治疗后,分别针对于治疗输血依赖性丘脑半球(transfusion dependent thalas-semia,TDT)和镰状细胞病(sickle cell disease,SCD)的患者长期随访研究。有4例TDT患者和3例SCD患者参与了该研究;这7例患者的年龄在13-21岁之间,在进行基因治疗4.6～7.9年前接受白消安骨髓消融治疗,然后接受中位随访的时间为4.5年。在3例SCD患者中,有两名患者的疾病生物学特征得到了临床缓解和修复,第3例患者的输血频率降低。TDT患者均无输血,并且这些患者的红细胞生成障碍和铁超载得到了改善[12]。

慢病毒经过不断的优化后,虽然已经减少了其恢复野生型HIV毒性的可能,但在临床上仍有感染情况发生。在一项应用BB305载体介导的自体CD34+细胞对输血依赖型β地贫患者进行基因治疗的研究中,一名患者在1/2期研究中成功接受了Beti细胞的治疗 (HGB-204;#NCT 01745120)后被诊断携带野生型HIV感染[13]。这是第一项关于LVV基因治疗导致野生型艾滋病毒感染的报道。该患者在接受Beti-cel基因疗法治疗后,在其体内检测到具有野生型 HIV和BB305载体衍生序列的病毒。此外,慢病毒介导的基因整合策略会产生遗传毒性风险,由于基因组的随机整合,仍有患者发生了与插入突变相关的致癌事件[14]。因此,提高LVV的生物安全仍然是需要继续研究的方向。

3 基因编辑策略

LVV介导的基因编辑策略依赖于高度特异性核酸酶研发,依靠LVV作为传递工具,将基因编辑工具递送到造血干细胞内,再通过DNA双链断裂及相关修复机制,在基因组目标区域发生特定变化,从而纠正存在缺陷的目的基因或调节其表达水平,发挥治疗作用。近年来,CRISPR/Cas9基因编辑工具发展迅速,但其较高的脱靶率也是急需解决的问题,开发一种新的一体化载体盒以及病毒样颗粒递送技术可以有效降低脱靶率。此外,shmiR载体通过γ珠蛋白重激活,也是基因编辑策略中的有效治疗方案。

3.1 CRISPR/Cas9

成簇规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9, CRISPR-Cas9)系统因其具有相对简单、可靠、精确、高效和低价的优势,是最常用的基因编辑工具[15]。CRISPR/Cas9系统需要通过载体将其递送进入目的细胞。在人类造血干细胞和祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs)的基因编辑上,LVV拥有比RNA和核糖核蛋白复合物(RNP)更高的递送CRISPR-Cas9系统效率,同时LVV还具有转导效率最强,毒性最小的特点[16]。然而,LVV介导的基因编辑虽然有较高的递送效率,但基因编辑技术脱靶率高的问题一直没有得到解决。IDLV是一种可以有效降低脱靶率的一体化载体盒[17]。IDLV降低脱靶效率的关键,是在CRISPR-v1的基础上删除了不必要的缓冲序列并且加入了SpI转录因子结合位点。经p24gag酶联免疫吸附试验检测病毒效价后,p24的产量增加了2.5倍,在转导入HEK293T细胞进行基因敲除后,GFP阳性信号7 d就减少了5倍,在移植后21 d观察到GFP阳性信号几乎完全耗竭。

3.2 病毒样颗粒

一直以来,基因编辑面临的最大挑战之一是脱靶问题[18-19]。常规LVV介导的基因编辑虽具有较高的递送效率,但会增加脱靶率。病毒样颗粒是由病毒的单一或多个结构蛋白自我组装形成的与天然病毒颗粒结构高度类似的蛋白颗粒[20]。基于LVV开发的病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)递送技术在保证了递送效率的同时,有效的降低了基因编辑的脱靶率和免疫反应等风险。

近几年,病毒样颗粒逐渐应用于基因编辑并受到极大关注。通过在Gag蛋白或Vpr蛋白的N端或C端融合表达Cas9蛋白实现核酸内切酶在细胞内递送。NanoMEDIC病毒样颗粒将FKBP12蛋白融合到Gag基因,再将FRB复合物与Cas9融合,在雷帕霉素存在的情况下,FKBP12蛋白与FRB复合物之间通过特异相互作用使Gag与Cas9蛋白相关联[21]。Nanoblades病毒样颗粒将Cas9融合在Gag的C-末端,当sgRNA与Gag-Cas9融合蛋白共表达时,Cas9 RNPs可以被包装到衣壳中,进而实现核酸内切酶在细胞中的递送[22]。Vpr是一种慢病毒调节蛋白,在病毒感染和病原体中具有重要功能。Vpr.Prot.Cas9病毒样颗粒将Cas9融合到慢病毒蛋白Vpr的N-末端,通过Vpr和Gag的p6结构域之间相互作用将Cas9蛋白有效地包装到慢病毒衣壳中[23]。总而言之,病毒样颗粒递送技术正处于快速发展阶段。并且由于有受体介导,病毒样颗粒递送技术可以选择性地转移到大部分目的细胞。对比与传统基因编辑递送方式如电转、纳米颗粒等方法,病毒样颗粒递送技术具有容易制备、特异性高和所需蛋白浓度低等特点。这种方法可以将可编辑的细胞类型扩展到临床上相关的未分裂细胞,例如造血干细胞和祖细胞。

3.3 载体shmiR

载体shmiR是一种新开发的通过激活胎儿血红蛋白来治疗β地贫的LVV[24]。成人体内的胎儿血红蛋白表达会受到BCL11A和γ珠蛋白阻遏物ZNF410的抑制。载体shmiR可以表达两种抑制物,同时靶向抑制BCL11A和 ZNF410的表达,进而重新激活胎儿血红蛋白,达到治疗β地贫的目的[25]。

4 问题与展望

目前,基因整合策略已经在国际上进行不同阶段的临床试验,已有多名患者脱离了输血依赖。但其高昂的治疗成本仍然是该策略推广的重要障碍,增加LVV的滴度和转导效率是降低成本方向之一。基因编辑策略是基于高度特异性核酸酶发展兴起的治疗策略。其转导效率强,毒性小的特点非常适合应用于临床。值得一提的是,基于LVV开发而来的病毒样颗粒虽然近年才被用于基因编辑,但它保证转导效率、降低脱靶率和免疫风险的特点极具治疗β地贫的优势,应用前景可期。因此LVV治疗β地贫的基础研究临床转化仍有广阔的探索空间。