百蕊草扩繁和栽培利用研究进展

2023-03-05高佳慧张晓明

草地学报 2023年2期

高佳慧，张晓明，唐芳

(内蒙古农业大学草原与资源环境学院，内蒙古呼和浩特 010010)

百蕊草(ThesiumchinenseTurcz.)，又名百乳草、地石榴、细须草等，属檀香科百蕊草属植物，为多年生半寄生草本植物[1]。百蕊草广泛分布于世界各地，在我国西南、华南、华中、华北、东北及西北地区均有分布，多生于潮湿地带或草甸、沙漠等边缘地带[2]。百蕊草是我国重要的药用植物，味微苦、性寒[3]，具有清热解毒、抗菌消炎、补肾涩精等功能，常被用来防治发炎、流感发热及各类急性炎症等[4]，故有“植物抗生素”的美誉，在我国中药材市场具有极高的市场价值和需求度。近些年，由于人们的过度采收、人类活动的加剧和生态环境的恶化，造成全国范围内百蕊草植株急剧减少，甚至在某些生态区消失，严重削减百蕊草产量。然而，药材厂商对百蕊草的需求却日益增多，供需矛盾更显突出。为满足百蕊草的市场需求，采取人工栽培以及组织扩繁等方式来提高百蕊草产量已迫在眉睫。但是，目前针对百蕊草的研究大多数集中在有效化学成分及药材品质方面，在人工栽培、快繁及育种等方面的研究相对较少，无法为百蕊草产业的快速可持续发展提供强有力的理论和技术支撑。

近年来，国家药品监督管理局等部门颁布《全国道地药材生产基地建设规划(2018—2025年)》和《中药材生产质量管理规范》[5]，明确了中药材人工种植的意义及产品质量保证规范；国家林草局等部门颁布《林草中药材野生抚育通则》《林草中药材生态种植通则》和《林草中药材仿野生栽培通则》等文件[6]，重点强调扩大中药材种植途径及建立相应种植规范。因此，在国家政策和市场需求的引导下，本文梳理百蕊草寄生生物学特性、实生植株的生长、组织培养快速繁殖、栽培利用及相关基础研究进展，探讨适宜百蕊草特殊型的栽培利用模式的可行性，为摆脱对野生百蕊草的资源依赖，扩大药材资源供给，实现百蕊草药用资源的可持续利用提供新思路。

1 百蕊草研究趋势分析

对百蕊草的研究自上世纪70年代起，几乎都集中在中药材应用方面，以及为数不多的化学成分研究。通过对中国知网所有有关百蕊草文献的整理与统计发现，直到2002年李育智[7]等对百蕊草中山奈酚的成分进行分离与鉴定，在随后几年间引来一些学者对其主要化学成分、提取工艺进行研究，但仍未形成较大规模。自2007年开始刊出对百蕊草种子内源抑制物的研究报道，2012年起对其种子方面的研究论文开始不断增加。此外，刘永松等[8]在2006年和陈培玉等[9]在2020年针对百蕊草生物、化学、药理等方面的研究进展进行了综述。由图1可知，自2011年开始出现有关百蕊草种子及组培方面的研究论文，至2016年相关论文数量呈大幅增长，表明关于百蕊草种子、组培体系的研究已逐渐被重视，构建完善的百蕊草组培体系和栽培体系将成为今后研究的热点内容。

图1 百蕊草发表论文数量分析Fig.1 Analysis on the number of papers published about Thesium chinense Turcz.注：图中各时间段论文数为自1972年起至今，所有百蕊草相关文章发表数量Note:The number of papers in each period in the figure is the number of all thymoscope-related papers published since 1972

2 百蕊草生物学特性研究进展

中国植物志等文献记载百蕊草为多年生草本植物。宋玲珊等[10]通过连续多年观察百蕊草植株个体的生长发育，未发现可存活2年以上的植株，表明百蕊草在长江中下游地区为二年生冷季型草本植物。其余大部分地区都是一年生个体。目前，关于百蕊草其他分布区生活型的研究未见深入报道。未来需对不同气候带系统的生活型进行观察研究，为百蕊草人工种植适宜区域的选择、不同气候带种植模式和栽培方式的优化提供参考依据。

宋玲珊[10]、张晓明[11]等学者通过对百蕊草的物侯期进行观察，发现自然条件下百蕊草实生苗出苗期为4—7月、营养生长期为7月、休眠期自8月下旬开始；百蕊草生长第1年根颈处不分枝，越冬休眠过程中开始发育根颈芽。翌年早春迅速发育，营养生长期为2月下旬—3月中旬，4月开始进入花果期，果实成熟后根不能正常休眠，腐烂而死。由于百蕊草具有休眠特性且生长周期较短，故宿根苗通常会在4月底进入枯萎阶段，实生苗也会在大约在6月底枯萎[12]。百蕊草在休眠期前后生物量的差异较大，株型也有不同程度的差别。探究百蕊草休眠时的生理特征、观察百蕊草的生长周期，可为人工栽培百蕊草提供科学准确的理论依据，为提高百蕊草产量和质量奠定基础。

百蕊草寄主广泛，包括大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)、苜蓿草(LotuscorniculatusL.)、白茅(Imperatacylindrica(L.) Beauv.)、夏枯草(PrunellavulgarisL)、牡蒿(ArtemisiajaponicaThunb.)、加拿大一枝黄花(SolidagocanadensisL.)、狗牙根(Cynodondactylon(L.) Pers.)、白茅(Imperatacylindrica(L.) Beauv.)、小麦(TriticumaestivumL.)等，共有11科28种植物[13]。百蕊草寄生于豆科植物时生长健壮、果实较大，但通常情况下更喜欢寄生于禾本科植物[14]。由于百蕊草属于半寄生植物，其维持植物生长发育所必需的水分全部取自于寄主，因此合适的寄主能够提高其存活率、改善其营养状况[15]。研究表明寄主植物会显著促进百蕊草的生长发育[16]，且不同寄主植物对百蕊草的生长发育和药材各活性成分含量产生显著影响。通过对不同寄主进行综合评比，结果表明生产百蕊草药材的优良寄主为鼠曲草(GnaphaliumaffineD. Don)、白茅和夏枯草。

百蕊草侧根生长多个圆球形吸器，可刺入寄主根皮层至髓部与导管融合，以夺取寄主水分和养分[17]。刘波等[18]利用GC-MS法鉴定百蕊草寄主-夏枯草的根系分泌物成分，研究其对百蕊草吸器的诱导作用，发现2,6-二甲氧基-对苯醌(DMBQ)可诱导百蕊草根系产生吸器。但是吸器的形成机制以及吸器在寄生行为中的具体作用未见深入报道。百蕊草的吸器形成及寄生行为与寄主物种、根系空间距离、相互作用强弱有关，该特性的深入了解对人工栽培百蕊草的过程中选择偏好性强、具有经济价值的寄主，提高种植效率具有指导意义。

3 百蕊草种子研究

3.1 百蕊草种子休眠特性

植物的休眠是植物在生长发育过程中生长或代谢出现停止的现象，存在于大多数植物。种子的萌发过程中，探究打破休眠的影响规律，能过有效促进种子萌发[19]。在通常情况下，当种子进入休眠状态后需经过1个季节才能萌发，并且极易在休眠期间丧失活力。百蕊草种子存在休眠特性，且萌发率较低，研究发现其浸提液能够使小麦种子萌发率显著下降[20]，表明百蕊草种子中的内源抑制物具有很强的生物活性，可抑制种子萌发。探究打破百蕊草种子休眠的方法，探寻合适的外源添加物，对延长百蕊草生长周期、提升种子萌发率、提高实生苗成活率具有重要意义。

3.2 百蕊草种子休眠的研究进展

为破除百蕊草种子休眠，揭示百蕊草种子休眠的机制，已有多位科学家进行了相关研究。罗夫来等[21]对百蕊草种子适宜萌发条件进行研究，发现在黑暗环境下，20℃～25℃能够有效促进百蕊草种子萌发。通过采用GA3处理与低温层积相结合的方法，测定百蕊草种子层积前后的糖含量、激素含量和含水量，运用高效液相色谱法分析破除种子休眠过程中的百蕊草生理变化，表明破除百蕊草种子休眠的最佳处理方法为：流水冲洗24 h后在500 mg·L-1GA3中浸泡24 h，再用低温层积处理150～180 d。利用赤霉素处理百蕊草种子，除可打破休眠外，还可使种子萌发提前，有效提升发芽率[22]。张成才等[23]通过试验得出相同结果。

张成才等[24]研究了不同激素及抑制剂对百蕊草种子休眠的影响。通过测定不同浓度的赤霉素(GA3)、乙烯利(ETH)、氟啶酮(FL)、油菜素内酯(BRs)浸泡百蕊草种子24 h后的裂壳率和发芽率，表明300 μmol·L-1ETH处理可有效提高种子发芽率，使得百蕊草种子裂壳率增加至43.43%、发芽率增加至83.5%，有效的解决了人工栽培百蕊草中种子萌发率低的问题。张成才等[25]研究了0，30，60，90，120 d 5个不同的变温层积处理，并测定每个处理下种子的酶活性、激素含量变化以及发芽率，结果表明破除休眠的最佳时间点是变温层积120 d，此时的酶活性逐渐升高，种子内营养物质和GA3，ABA向生理成熟状态转化。

4 百蕊草的组织培养及快速繁殖研究

4.1 构建百蕊草组培体系的必要性

植物的组培技术又称为离体培养，通过消毒、杀菌、筛选适宜培养基以及适当的植物激素，在无菌条件下对植株各部分组织进行培育，以此产生愈伤组织，再分化形成再生植株。目前，国内外对植物组织培养的应用研究已扩大到单倍体育种、细胞育种、胚胎育种等方面，并获得了较多研究成果[26]。植物组织培养不仅可以解决远缘杂交中不亲和性障碍问题，还能够通过培养得到单倍体及其他多倍体。此外，利用植物组织培养方式大规模生产植物次生代谢产物，已成为生产一些植物源药剂的重要途径。

袁艺等[27]在2002年对野生百蕊草与其组培苗中山萘素含量进行研究，结果显示二者山萘素含量相差不大，且发挥药效基本一致。随后袁艺等[28]对百蕊草野生与组培苗进行了抑菌抗炎的研究，结果表明不论是野生百蕊草，还是组培百蕊草的抑菌和抗炎作用几乎相等。可见，百蕊草组培苗可以代替其野生品种。因此构建完善的百蕊草组培体系十分重要，为大规模生产百蕊草提供依据，缓解市场需求，实现其野生资源的替代。

百蕊草组织培养可通过愈伤组织培养、丛生芽诱导和生根培养等系列过程获得大量植株，是实现百蕊草规模化种植和可持续开发利用的关键技术。目前国内外已有一定数量的学者对百蕊草组织培养进行了研究，但总体上存在着诱导率低、实验周期长、扩繁系数低等问题，迫切需要建立稳定、高效的百蕊草离体培养技术。

4.2 百蕊草组织培养研究进展

目前我国对百蕊草组培快繁方面的研究主要集中在外植体选择、外植体消毒时间、不同培养基的激素配比及浓度、不同外援添加物及浓度等对百蕊草组织培养体系的影响。相关成果归纳总结于表1中。

在进行组培实验时，目前的相关研究大多选取百蕊草的茎和叶作为外植体。刘向阳等[29]在对外植体消毒时，首先将叶片经自来水冲洗干净后用0.1%的氯化汞溶液消毒5～8 min，再用无菌水冲洗3次。吴峰等[30]则采用：75%酒精浸泡10 s，无菌水清洗2次。再用0.1%的升汞溶液消毒5 min，无菌水浸洗3次后，再用无菌水浸泡10 min，清洗2次。黄浩等[31]的消毒方式为：流水冲洗2 h，然后用洗衣粉水和低浓度84消毒水的混合液浸泡5 min，并同时用毛刷轻轻地刷洗芽基部，之后用流水冲洗5 min。罗查梅等[32]经过相关实验得出最佳消毒方式为：先用流水冲洗净，再用75%酒精溶液涮洗10 s，后用无菌水洗1～2次，再置于0.1%氯化汞溶液中浸泡8 min，之后统一用无菌水清洗4～5次。

由于实验目的、消毒方式、激素选择的不同，所得出的最佳诱导培养基的配方也存在差异。为了探究不同激素对百蕊草愈伤组织产生的影响，刘向阳等通过在基础培养基中添加不同浓度的6-BA，NAA和2,4-D，连续培养30 d后测定愈伤组织鲜重、增重及增殖率，最终得出百蕊草愈伤组织诱导的最佳培养基。有研究者设置了4种不同激素浓度的MS培养基，经过60 d后统计分析诱导率，得出最适培养基配方为MS+1.0 mg·L-12,4-D。通过研究不同浓度和种类的激素配比，确定MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA为愈伤组织最适诱导培养基。此外，在对百蕊草离体快繁体系技术优化的实验中，通过将6-BA浓度设置为7个不同梯度，得出结论MS+2 mg·L-16-BA+0.13 mg·L-1NAA为最适诱导愈伤培养基。

罗查梅等通过将愈伤组织转接到不同6-BA和NAA配比的MS培养基中，培养30 d后得到最适丛生芽培养基为MS+1.5 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA。赵维萍等[33]为了研究噻苯隆(TDZ)对百蕊草丛生芽诱导的影响，将百蕊草愈伤组织接种于不同浓度的TDZ培养基中，培养30 d后发现MS+1.5 mg·L-1TDZ为最适诱导丛生芽培养基；在进行诱导生根实验时，确定最适生根培养基为加入60 mg·L-1ABT生根粉，浸泡1 h。江芹等[34]通过诱导丛生芽和生根实验，发现诱导丛生芽的最佳培养基是MS+1.5 mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-12,4-D；此外，添加60 mg·kg-1ABT可使生根率达到76.6%。

黄燕芬等[35]为了建立百蕊草悬浮细胞培养体系，探究了不同营养物质对该体系的影响。通过选取生长度相似的淡黄色百蕊草的愈伤组织为材料，接种于配置好的液体培养基中，设置pH值浓度为5.7～5.9，在温度为24℃、转速115 r·min-1条件下暗培养3天后转为弱光培养。研究表明最适于百蕊草细胞的悬浮培养条件为以MS为基本培养基，70 mmol·L-1的氮浓度，1.3 mmol·L-1的磷酸盐浓度。

在百蕊草愈伤组织培养影响因素的相关研究中，通过设置不同pH值及添加不同浓度的蔗糖和葡萄糖至百蕊草愈伤诱导培养基中，结果表明，最有利于百蕊草愈伤组织诱导和生长发育的pH值约在5.8～6.0之间，且添加30 g·L-1的蔗糖作为外源添加物，对百蕊草愈伤组织的增长具有明显促进作用[13]。研究者比较了加入不同外源添加物的影响，结果表明在植株扩繁阶段添加10 mg·L-1的椰子汁作为外源添加物，能够给百蕊草生长阶段提供营养；其次在组培过程中添加适量的活性炭对百蕊草的生长也是有益的[17]。

表1 百蕊草组培外植体和最适培养基汇总Table 1 A summary on the tissue culture explants and optimal media for Thesium chinense Turcz.

5 百蕊草的栽培利用

5.1 百蕊草人工栽培现状

百蕊草是我国重要的中草药资源。由于其分布较广、植株较小、产量较低，近年来的大量采挖导致百蕊草野生资源日益稀缺[36]，为保护百蕊草资源不再减少并满足人们日益增长的需求，亟待研究百蕊草的人工栽培技术，优化百蕊草的人工栽培体系。然而，由于百蕊草属半寄生植物且具有生长周期短、产量低等特点，国内至今未出现大范围种植百蕊草成功的案例。

在人工栽培百蕊草过程中，不仅要关注产量的问题，其质量的把控也十分重要，薄层色谱法测定百蕊草中山奈酚的含量是百蕊草质量控制的方法之一[37]。药用植物百蕊草抗菌、消炎等作用是其多种成分联合作用的结果[8]。王尧等[38]研究表明百蕊草中的紫云英苷发挥抗炎、抗氧化的作用，且能够抑制破骨细胞的骨吸收。郑玲玲等[39]在对百蕊草中黄酮类化合物的测定中表明：人工栽培百蕊草的百蕊草素Ⅰ、紫云英苷等含量均显著高于野生百蕊草。而张成才等[40]通过对人工栽培与野生百蕊草中主要成分的含量对比研究分析发现，百蕊草素Ⅰ和紫云英苷在人工栽培百蕊草中的含量与其野生品种差异显著，暂不符合药用要求。不同的植物生长调节剂，也会对植物的生长发育产生影响[41]。人工栽培与野生材料在成分方面存在差异，可能是由于在栽培过程中的养分管理、水分管理等栽培条件产生了偏差。而这也是导致目前人工栽培百蕊草未产生规模化的重要原因。因此，研发百蕊草人工栽培技术时，扩大其产量并且保障质量的研究还需进一步加强。

5.2 百蕊草栽培利用研究进展

限制人工栽培种植的因素主要有：气候、土壤类型、种子萌发和植株根部养分积累量等。在人工栽培时，需要考虑土壤理化性质、水分需求等栽培技巧[42]。张玮玮等[43]通过采集野生百蕊草植株，充分利用地理信息系统数据库中土壤数据、气候因子和基础地理信息等三大数据库进行分析后发现：中国的东北、华东、华北等地区是适宜百蕊草生活的最佳生态区，主要位于温带、亚热带季风气候区；适宜的土地类型主要为褐土、红壤土、棕壤土等；适宜的自然生长区主要是光照较强地带、气候温暖湿润地带、靠近水源和水量充足地带。因此，在人工栽培百蕊草时需选取光照强、气候温暖湿润的地区，且在栽培过程中需注意及时浇水，保证根部湿润。Tang等[44]利用Max Ent模型预测了其适宜栖息地，确定了其适宜区域的潜在迁移趋势，并发现温度是影响人工栽培百蕊草的最主要因素。宋玲珊等[45]通过野外采样发现，光照和水分能够直接影响到百蕊草地上部分分枝数量，从而影响其品质。

张成才等[24]对百蕊草的栽培条件进行了研究。通过设置3个不同温度、湿度、基质配比和光照时间进行单因素对照实验，观察百蕊草植株成活数，计算成活率。研究结果表明：将温度和湿度分别控制在24℃和75%，蛭石、河沙、营养土、椰糠按照1∶1∶1∶1的比例配置土壤基质，是最适宜百蕊草人工栽培的条件。

百蕊草是半寄生植物，对生长环境具有很高的要求。研究者为探究百蕊草人工栽培模式，对百蕊草物候期及越冬休眠时间进行了研究。通过标记50株百蕊草，每隔15 d观察1次物候期，结合硫酸蒽酮法和DNS法测定不同生长期时百蕊草的可溶性糖和淀粉含量以及淀粉酶活力，发现百蕊草根内淀粉和可溶性糖可以相互转化，使得百蕊草在休眠过程中的抗逆能力增强，从而得以顺利越冬。1年生百蕊草植株生长期具有丰富的淀粉储藏在主根，因此在人工栽培百蕊草时，需要考虑提高1年生植株根部营养积累量。宋玲珊等[46]根据研究也得出相同结论。