细胞焦亡在肝脏损伤中作用的研究进展①

孙 伟 刘杉杉 陆安法 罗 杰 高俊波 何思雨 （铜仁职业技术学院，铜仁 554300）

程序性细胞死亡（programmed cell death， PCD）在宿主生长发育以及抵抗外界因素干扰的过程中起重要的作用［1］。常见的PCD包括细胞凋亡、坏死、焦亡、铁死亡、自噬和效应性细胞死亡等多种类型。其中，对于细胞凋亡的研究最为明确。然而，目前对细胞焦亡的研究尚处于起步阶段，有待于更加广泛和深入的研究［2］。细胞焦亡又被称为炎症细胞坏死，是一种新发现的PCD，主要以细胞肿胀、胞膜破裂、炎症因子和细胞内容物释放为主要特征。细胞发生焦亡后，在致炎因子的刺激下，细胞会释放大量的促炎因子IL-1β和IL-18［3］。肝脏作为机体内最大的实质器官，具有维持内环境稳态、能量供应、维持新陈代谢、促进生长发育以及免疫调节等多种功能［4］。肝脏独特的功能和解剖位置，使其对外源性物质高度敏感，因此成为各种有毒有害物质作用的靶点。病毒性肝炎、酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）、非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）以及中毒性肝病等多种肝脏疾病与细胞焦亡密切相关。本文主要对细胞焦亡激活的机制和细胞焦亡在肝脏相关疾病的研究进展进行综述，以期为研究细胞焦亡在肝损伤致病机理的作用提供一定的参考。

1 细胞焦亡激活的机制

1.1 经典途径 在经典细胞焦亡途径中，主要依赖于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）激活，炎症小体起重要作用。炎症体是一组蛋白质复合物，可被多种损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns， DAMPs）和病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）所识别，控制IL-1β和IL-18等促炎细胞因子的生成［5］。不同的炎症小体所感知的内外界刺激信号有所差异，但在各种因素的作用下具有招募并激活Caspase-1的作用［6］。黑色素瘤缺乏因子-2（absent in melanoma 2，AIM-2）和NLRC4识别具有特异性，分别与双链DNA和菌体特异性蛋白相结合［7-8］。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）是由NLRP3、ASC和pro-Caspase-1三部分所组成，是目前研究最透彻的炎症小体［9］。NLRP3可被细菌、病毒、DAMPs、穿孔素等多种因素激活［10-11］。NLRP1可以感知细菌细胞壁的组成部分胞壁酰二肽，在抵抗细菌感染中发挥作用［12］。

研究表明，Gasdermin家族蛋白D（GSDMD）是调节细胞焦亡的关键底物［13］。经炎症小体活化后的Caspase-1可将GSDMD裂解成22 kD和31 kD大小并具有活性的N端与C端片段，GSDMD-N可裂解细胞膜上含有磷脂酰肌醇/心磷脂的脂质体，在细胞膜上进行“打孔”［14］。同时，Caspase-1可完成对pro-IL-1β和pro-IL-18前体物质切割、成熟，形成具有活性的促炎因子IL-1β和IL-18。IL-1β和IL-18可穿过GSDMD-N在胞膜上形成的“孔道”分泌到细胞外，从而诱导炎症反应的发生。NLRP1炎症小体同样具有激活经典细胞焦亡路径的作用，但GSDMD蛋白是否参与了NLRP1炎症小体依赖的经典细胞焦亡路径尚不明确。

1.2 非经典路径 在非经典细胞焦亡途径中， 细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可直接与Capase-4/5/11结合，诱导细胞发生焦亡（图1）。活化后的Caspase-4/5/11在将GSDMD裂解成N、C两个片段的同时，可通过与NLRP3炎症小体结合，进一步活化下游因子Caspase-1，最终将成熟的IL-1β分泌到细胞外。此外，Pannexin-1通道蛋白可在Caspase-4/5/11作用下，打开P2X7细胞膜通道并释放ATP，在细胞膜上形成“孔洞”，诱导细胞发生焦亡。Pannexin-1通道蛋白激活后，可促进细胞内K+离子释放，进而激活NLRP3炎症小体，同样具有促进IL-1β分泌的效应［16］。无论是经典途径还是非经典途径，GSDMD蛋白的裂解都起到了十分关键的作用［17］。

图1 细胞焦亡激活的模式图［15］Fig.1 Patterns map of pyroptosis activation［15］

1.3 其他引起细胞焦亡激活的因子 最新研究表明，Gasdermin家族蛋白E（GSDME）同样具有介导细胞焦亡的作用［18］。与GSDMD不同的是，GSDME可被细胞凋亡关键因子Caspase-3在特异位点进行切割，切割后的GSDME-N片段同样具有穿透细胞膜的功能。Caspase-3在肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor，TNF-α）的作用下激活，诱导细胞发生凋亡。然而，如果该细胞可表达GSDME蛋白，那么细胞死亡方式会迅速转向焦亡，甚至直接发生焦亡。在细胞中添加Caspase抑制剂或者将GSDME基因敲除和（或）降低，均会阻止细胞焦亡的发生。体内试验表现出相同的效果，化疗药物对GSDME基因敲除小鼠所产生的副作用会明显降低［19］。通常认为，Caspase-3是细胞发生凋亡的重要标志物之一，这一发现将细胞凋亡和细胞焦亡两种不同的PCD联系在一起，对进一步探讨细胞焦亡的发生机制具有重要作用。

2 细胞焦亡在肝脏损伤中的作用研究

细胞焦亡的发生有助于机体及时清除受损伤的细胞，然而过度的细胞焦亡可引起大量细胞死亡，造成严重的组织损伤，甚至会导致器官衰竭，与多种疾病的发生紧密关联［20］。由于机体内“肝-肠轴”的存在，菌群失调后肠道细菌代谢产物会进入肝脏，因此LPS是导致肝细胞焦亡发生的重要因素［21］。研究发现，细胞焦亡与病毒性肝炎、ALD、 NAFLD以及肝脏中毒等多种肝脏疾病有关，在肝脏损伤的发生、发展过程中起重要作用［22］。因此，研究肝损伤过程中细胞焦亡发生的分子机制，对于阐明肝脏疾病发生的机制，寻找相关疾病的治疗方案具有积极作用。

2.1 细胞焦亡与病毒性肝炎的关系 机体内细胞焦亡与免疫调节之间的关系受到严格调控。然而，细胞过度发生焦亡会诱导机体出现强烈的免疫反应，引起大量细胞死亡，最终导致严重疾病的发生。研究发现，丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）可通过Caspase-1和Caspase-3两种信号通路诱导细胞发生焦亡。HCV感染细胞及周围细胞出现Caspase-1上调表达，这与HCV的发病机制密切相关。HCV RNA可直接诱导感染肝细胞内NLRP3组装和活化［23］。NLRP3激活后分泌的IL-18可刺激NK细胞合成IFN-γ，从而抑制HCV复制［24］。从发生焦亡的细胞中释放出的DAMPs具有募集免疫细胞的功能，进而促进炎症反应的发生［25］。现已证实，NLRP3激活后，肝脏枯否细胞分泌的IL-1β是HCV患者炎症出现放大反应的来源。慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染可导致肝纤维化、肝硬化、肝功能衰竭以及肝癌［26］。HBV核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）参与细胞焦亡的发生。经HBcAg治疗的HBV患者外周血单核细胞IL-18的分泌显著增加，而Caspase-1抑制剂可完全阻断IL-18分泌。这与HBeAg阳性患者外周血单核细胞IL-18分泌量降低的报道基本一致［27］。YU等［28］发现，HBV通过抑制核转录因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）依赖的信号途径，从而抑制NLRP3和IL-1β蛋白表达，同时能够抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成。ROS作为细胞代谢的副产物，在调节信号传导通路，应对细胞内外环境变化起到重要作用［29］。ROS过度生成会破坏与抗氧化物质之间的平衡，最终导致机体出现氧化应激，进而造成细胞和组织损伤［30］。ROS水平的增加可促进炎症小体和NF-κB等炎症相关信号因子的释放［31］。除了病毒性肝炎外，Caspase-1依赖的细胞焦亡途径也参与自身免疫性肝炎中。研究发现，人白细胞介素-1受体拮抗剂（rhIL-1Ra）可通过抑制NLRP3诱导的细胞焦亡信号通路，起到抑制肝脏炎症发生的作用［32］。从细胞焦亡参与病毒性肝炎致病机理的角度出发，有望寻找出新的治疗病毒性肝炎的有效措施。

2.2 细胞焦亡与ALD的关系 ALD是指由于酒精的大量摄入而造成的与肝损伤密切相关的一系列疾病。酒精过量摄入造成的ALD，与细胞焦亡等在内的各种PCD密切相关。临床上，ALD一般包括脂肪变性、纤维化、酒精性肝炎（alcoholic hepatitis，AH）、肝硬化和肝细胞癌［33］。先天性免疫细胞的激活、全身性炎症的发生是ALD发病的主要因素。

RNA测序分析发现，Caspase-11/4激活后，活化的GSDMD可通过Caspase-11/4-GSDMD信号通路诱导细胞焦亡的发生，这可能是AH发病的机制之一［34］。有意思的是，在AH模型小鼠中，Caspase-1并未被激活，这有待于进一步验证。此外，研究还发现，采用抑制CCR2/5信号通路的药物，可有效降低GSDMD裂解，有效缓解酒精对肝脏的损伤［34］。FU等［35］发现，通过抑制细胞焦亡的发生可缓解AH患者的临床症状，并降低患病率。

ATP和可溶性尿酸等物质作为DAMP，可在酒精的作用下，从受损伤的原代肝细胞中释放出来，并触发炎症小体依赖的炎症因子的释放［36-37］。细胞内物质介导的细胞焦亡，具有刺激和维持ALD的炎症反应循环状态的作用。此外，残留在肝细胞中的酒精代谢物也会促进ROS生成，导致线粒体功能发生障碍，从而增加肝细胞对炎症细胞因子的敏感性［38］。从以上研究可知，降低或是抑制细胞焦亡的发生，对于缓解或治疗ALD具有一定的积极作用。

2.3 细胞焦亡与NAFLD的关系 NAFLD是指在没有大量摄入酒精、药物或存在其他导致肝脂肪变性因素的情况下，脂质在肝脏组织内积聚而诱发的炎症脂肪性肝病，是一种与胰岛素功能紊乱、遗传关系紧密的代谢性肝损伤。NAFLD覆盖了从单纯性脂肪变性到脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）等广泛的范围，NASH可能导致肝脏出现纤维化，进一步发展成为肝硬化，并增加罹患肝癌的风险［39］。

NAFLD小鼠模型中发现，骨髓源细胞和肝脏实质细胞中Caspase被激活，并逐渐出现炎症反应和纤维化等病理变化［40］。其发病机理可能是肝细胞和免疫细胞释放的脂肪酸和DAMP以及尿酸激活了NLRP3炎症小体。研究表明，ROS对发生脂肪变性的肝细胞具有致命性损伤［41］。肝细胞受损后，线粒体结构完整性被破坏，会释放出DNA、ROS和ATP等DAMPs，并可直接或间接与硫氧还蛋白结合蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）和P2X嘌呤受体7结合，从而激活NLRP3炎症小体［42-43］。单纯发生脂肪变性的动物很难观察到活化的NLRP3，然而却在NAFLD/NASH动物和人类模型多次得到证实［44］。越来越多的数据表明，细胞焦亡已经成为联系脂肪变性和NASH的纽带［45］。细胞焦亡释放的IL-1β对其他炎症细胞因子的分泌具有级联放大的效应，IL-1β信号通路介导的炎症反应是导致肝脏发生炎症、脂肪变性和纤维化等病变的关键分子，在NAFLD发病机制中起到重要作用［46］。然而，与细胞焦亡相关的另一种炎症细胞因子IL-18在NAFLD/NASH疾病发展中起到了相反的作用。IL-18基因敲除后的小鼠肝脏中的糖异生基因表达水平明显较高，更易患肥胖症、贪食症并对胰岛素具有一定的抵抗作用［47］。细胞焦亡与NAFLD/NASH损伤的关系，还有待于进一步研究。

2.4 细胞焦亡与中毒性肝损伤的关系 短期摄入低浓度的有毒有害物质一般不会对机体造成明显的损伤。然而，有毒有害物质长期摄入或者药物的过量使用都会引发肝脏损伤，甚至会造成急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）。

临床上，对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）的过量服用是ALF最常见的诱因之一。ALF主要以大量肝细胞功能紊乱为主要特征，从而引起严重的肝损伤［48］。APAP可通过线粒体氧化应激、核DNA断裂和线粒体通透性转变直接损伤肝细胞［49］。研究还发现，APAP诱导肝细胞死亡后，释放的ATP和NAD在激活P2X7分子后，会触发NLRP3炎症小体，最终造成肝损伤［50］。因此，DAMPs介导的先天性免疫信号炎症反应，激发了APAP诱导的肝毒性［51］。Cu是体内必需的微量元素，然而过量摄入后会造成多个器官损伤。研究发现，长期暴露在Cu作用下的鸡源性肝细胞，细胞存活率会显著下降，且Caspase-1、IL-1β、IL-18和NLRP3等细胞焦亡相关因子表达水平显著上调［52］。因此推断Cu可能诱导了肝脏细胞焦亡的发生。苯并芘（α）是世界公认的致癌物，且分布广泛。肝脏是苯并芘（α）代谢的主要场所。研究发现，苯并芘（α）可导致多种炎症因子的分泌，诱导炎症反应的发生。刘俊义［53］以HL-7702肝细胞为研究对象，结果显示苯并芘（α）可诱导肝细胞焦亡，这可能是造成肝中毒损伤的重要机制之一。肝中毒性损伤时有发生，细胞焦亡为缓解肝毒性损伤提供了新的研究角度。

3 小结与展望

细胞焦亡是一种新发现的PCD，与肝脏疾病的发生密切相关。然而，细胞焦亡是如何引起肝脏损害以及细胞焦亡在肝脏疾病发生过程中起到怎样的作用？这些问题还有待于进一步研究和阐述。细胞发生焦亡后，释放的炎症因子不仅可以增强机体对致病因子的抵抗力，还可以通过诱导细胞焦亡的发生从而抑制肝细胞的增殖和迁移。然而，过度的细胞焦亡发生会加重炎症反应的生成，造成肝脏损伤，甚至会引起肝纤维化和癌变。因此，探讨细胞焦亡与肝脏损伤的关系，可为肝病的防治提供新的思路和方法。