生物信息学分析SLC22A11在乳腺浸润癌进展中的作用和潜在调节机制①

徐梦溪 郭 强 左杰斌 李 艳 甘凤娇 孙素红 （遵义医科大学附属医院甲乳外科，遵义 563000）

据报道，2020年新发乳腺癌患者有279 100例，其中有男性患者2 620例，女性患者276 480例；病死的乳腺癌患者有42 690例，其中有男性患者 520例，女性患者42 170例。乳腺癌是女性癌症中最常发的和癌症相关死亡性恶性肿瘤类型中常见的类型之一，其发病率占女性癌症患者的30%，病死率占女性癌症患者的15%，排名分别居第一和 第二［1］。基于雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人类表皮生长因子2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）可将乳腺癌分为4种亚型，分别为luminal A型（ER阳性，PR阳性或高表达，HER2阴性，Ki-67低表达）、luminal B型（ER阳性，PR阴性或低表达，HER2阴性，Ki-67高表达）、Her-2过表达型（ER阴性，PR阴性，HER2阳性）和Basal-like型（ER阴性，PR阴性，HER2阴性）［2］。乳腺浸润癌（breast invasive carcinoma，BRCA）是常见的乳腺癌类型，这类癌症患者的预后往往较差。目前，根治性切除、局部治疗和全身治疗是BRCA患者最典型的治疗方法，且在BRCA患者治疗过程中发挥延缓癌症患者生存期和改善患者临床症状的作用［3］。BRCA患者的远期预后受多方面制约，往往不能令人满意。近年来，新发现的生物标志物在BRCA患者，尤其是晚期患者治疗中显现出极大的治疗价值。例如，REN等［4］发现三阴性乳腺癌细胞中PDL1表达阳性，PDL1蛋白表达水平与肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）中PDL1表达水平相关；PDL1 mRNA表达水平与Ki-67、Basal-like分型、肿瘤分级和TILs中PDL1表达水平显著相关；TILs中PD1表达阳性与患者无疾病进展和总生存期（overall survival，OS）显著相关。WANG等［5］证实在肿瘤细胞和浸润淋巴细胞中PD-L1表达率分别为8.5%和25.1%。TILs中PD-L1表达与组织学分级和表达丰度相关。TILs中PD-L1表达水平和患者淋巴结转移与预后不良显著相关，且是患者OS的独立影响因素［6］。提示开发新的有效性靶点以提高BRCA患者生存期和患者生存质量极其重要。

药物产生耐药性的机制之一是肿瘤细胞中细胞毒性药物的积累下降，这与跨膜ATP结合域（ATP-binding cassette，ABC）转运蛋白介导有关［6］。目前研究证实，癌症组织中ABC家族转运蛋白表达水平异常，且与癌症进展相关［7-8］。例如，GUO等［8］发现ABC家族成员B5（ABC member B5，ABCB5）在结直肠癌（colorectal cancer，CRC）患者外周血中过表达，其表达水平升高与CRC进展相关。干扰 ABCB5表达可显著降低肿瘤细胞的侵袭能力。YAMADA等［9］证实ABC家族成员ABCC1、ABCC11和ABCG2在三阴性乳腺癌组织中表达水平显著升高，ABCC1和ABCC11表达水平与较短的无疾病生存期（disease-free survival，DFS）相关，在三阴性乳腺癌HER2阳性患者中上调ABCC11表达水平与不良的DFS相关。另外，溶质载体（solute carrier，SLC）转运蛋白家族可转运氨基酸、脂质、蛋白质、药物等，在癌症组织中出现异常表达，且与癌症进展相关［10-11］。例如，与正常乳腺组织相比，SLC39A1、

SLC39A3、SLC39A4、SLC39A5、SLC39A6、SLC39A7、SLC39A9、SLC39A10、SLC39A11和SLC39A13在乳腺癌组织中表达水平上调。SLC39A8和SLC39A14在乳腺癌组织中表达水平下调。SLC39A2、SLC39A3、SLC39A4、SLC39A5、SLC39A7、SLC39A12和SLC39A13表达水平提高与乳腺癌患者OS显著相关。SLC39A6和SLC39A14表达水平降低与乳腺癌OS显著相关。SLC39A7可促进乳腺癌细胞增殖和克隆［10］。SLC27A4在乳腺癌组织及其亚型中过表达。沉默SLC27A4表达可使乳腺癌细胞生长受到抑制，细胞周期阻滞，细胞迁移和侵袭能力下降，并抑制上皮间质转化［11］。提示SLC家族成员在癌症中具有重要的生物学作用。

溶质载体家族22成员11（solute carrier family 22 member 11，SLC22A11）是SLC家族成员，位于染色体11q13.3。研究发现，与胰腺正常组织相比，SLC22A11在胰腺癌组织中的表达水平显著下调。SLC22A11表达水平下降与胰腺癌血管浸润相关［7］。目前尚未报道SLC22A11在BRCA进展中的作用及其潜在的调节机制。因此，本研究利用多数据库探究SLC22A11在BRCA进展中的作用和潜在调节机制。

1 材料与方法

1.1 Oncomine Oncomine数据库是大型综合在线数据库，数据来源于TCGA和GEO数据库。本研究利用Oncomine数据库探究SLC22A11在泛癌组织中的表达。筛选条件：①基因名：SLC22A11；②P值：0.05；③倍数变化：1.5；④数据类型：mRNA。

1.2 UALCAN UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu）是一个基于TCGA数据库二次分析和挖掘的网站，能提供基因在癌症组织中的表达水平、生存分析、相关性分析、DNA启动子区甲基化表达数据等。本研究利用UALCAN数据库验证BRCA组织中SLC22A11及其甲基化水平，并分析SLC22A11及其甲基化水平与BRCA患者临床病理学特征间的关系。

1.3 TCGA TCGA数据库具有数据量大、时效性强、易于获取等优点。在TCGA数据库中下载BRCA转录组数据（113例正常乳腺组织和1 109例BRCA组织）及其临床信息，剔除临床数据不全的BRCA患者，以验证SLC22A11在BRCA组织中的表达水平及其在患者预后中的价值。

1.4 Kaplan-Meier Plotter数据库 Kaplan-Meier Plotter数据库数据来源于TCGA和GEO两大数据库。使用该数据库分析SLC22A11表达水平在BRCA及其亚型Basal、Luminal和HER2过表达型患者预后中的价值。

1.5 基因富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA） GSEA是分析基因表达的一种方法。以SLC22A11表达中位数值将TCGA BRCA基因表达数据分为高表达组和低表达组，并按照一定的基因排序方式探究SLC22A11对各基因的影响，预测SLC22A11可能参与BRCA进展的调节机制［12］。筛选标准：NOMP＜0.05。

1.6 TIMER TIMER数据库是常用的基因免疫相关数据库。在该数据库差异表达模块中分析SLC22A11在泛癌组织中的表达，在基因模块中分析SLC22A11表达水平与BRCA及其亚型免疫细胞浸润间的关系，在相关性分析模块中分析SLC22A11表达水平与BRCA及其亚型免疫细胞浸润标志物间的关系。

1.7 统计学分析 使用Perl语言和R语言处理 TCGA数据库基因表达数据。Wilcoxon秩和检验分析SLC22A11在BRCA组织中的表达。Kaplan-Meier生存分析检测SLC22A11表达水平与患者OS间的关系。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SLC22A11在泛癌组织中异常表达 在Oncomine数据库中，SLC22A11在脑神经癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌、骨肉瘤等组织中表达水平降低，在宫颈癌、CRC、肝癌等组织表达水平升高（图1A）。在TIMER数据库中，与正常组织相比，SLC22A11在BRCA、BRCA亚型、肾脏肾乳头状细胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP）等组织中表达降低，在结肠腺癌（colon adenocarcinoma，COAD）、肾脏肾透明细胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）、肝 细胞癌（liver hepatocellular carcinoma， LIHC）等组织中表达显著升高（图1B）。

2.2 SLC22A11在乳腺癌组织中的表达水平显著降低 图1显示SLC22A11在乳腺癌组织中表达水平以下降为主。详细地说，SLC22A11在乳腺癌亚型Mixed lobular and ductal breast carcinoma、Mucinous breast carcinoma、Invasive ductal and lobular carcinoma、Male breast carcinoma、Invasive lobular breast carcinoma、Invasive breast carcinoma、Invasive ductal breast carcinoma、Ductal breast carcinoma in situ中表达水平显著降低（表1）。另外，SLC22A11在乳腺癌亚型luminal型、Her-2过表达型和Basal-like型组织中表达水平均显著降低（图1B）。

表1 Oncomine数据库中SLC22A11在乳腺癌组织中的 表达水平Tab.1 Expression level of SLC22A11 in breast cancer tissues in Oncomine database

图1 SLC22A11在泛癌组织中的表达水平Fig.1 Expression level of SLC22A11 in pan-cancerous tissues

经TCGA和UALCAN数据库验证发现SLC22A11在非配对和配对BRCA组织中的表达显著降低 （图2A～C）。另外，在UALCAN数据库中，乳腺癌组织中SLC22A11甲基化水平显著升高（图2D）。SLC22A11甲基化水平与SLC22A11表达水平呈现相反关系。

图2 SLC22A11在BRCA组织中的表达及其甲基化水平 异常Fig.2 Expression of SLC22A11 and its aberrant methylation level in BRCA tissues

2.3 SLC22A11与BRCA患者临床病理学特征相关 SLC22A11表达水平与BRCA患者种族（CaucasianvsAsian）、性别（MalevsFemale）、年龄［Age（21～40 Yrs）vsAge（81～100 Yrs）；Age（41～60 Yrs）vsAge（61～80 Yrs）；Age（41～60 Yrs）vsAge（81～100 Yrs）；Age（61～80 Yrs）vsAge（81～100 Yrs）］、TNBC亚型（LuminalvsHER2Pos；LuminalvsTNBC-BL1；LuminalvsTNBC-BL2；LuminalvsTNBC-IM；LuminalvsTNBC-LAR；LuminalvsTNBC-MSL）、主要亚型（LuminalvsHER2 Positive；LuminalvsTNBC）、组织学亚型（IDCvsILC；IDCvsMucinous；ILCvsMixed；ILCvsOther；ILCvsMucinous；ILCvsMetaplastic；ILCvsMedullary；MixedvsMucinous；OthervsMucinous）、Menopause状态（Pre-MenopausevsPeri-Menopause；Pre-MenopausevsPost-Menopause）、淋巴结转移（N0vsN3；N1vsN2；N2vsN3）和TP53突变（TP53-MutantvsTP53-NonMutant）相关（图3）。

图3 SLC22A11表达水平降低与BRCA患者临床病理学 特征相关Fig.3 Decrease of SLC22A11 expression is related to clinicopathological features of patients with BRCA

SLC22A11甲基化水平与BRCA患者种族（CaucasianvsAsian）、年龄［Age（21～40 Yrs）vsAge（81～100 Yrs）］、淋巴结转移（N0vsN1）和TP53突变（TP53-MutantvsTP53-NonMutant）相关（图4）。

图4 SLC22A11甲基化水平升高与BRCA患者临床病理学特征相关Fig.4 Increase of SLC22A11 methylation level is related to the clinicopathological characteristics of BRCA patients

2.4 SLC22A11表达水平降低与BRCA患者预后不良显著相关 在TCGA数据库中，SLC22A11表达水平降低与BRCA患者短OS显著相关（图5A）。在Kaplan-Meier Plotter数据库中，SLC22A11表达水平降低与BRCA患者无复发生存期（recurrence-free survival，RFS）显著相关（图5B）。深入研究发现，SLC22A11表达水平降低与BRCA患者RFS相关的ER阳性、ER阴性、HER2阴性、淋巴结阴性、亚型Basal-like型、Her-2过表达型、luminal A型和luminal B型显著相关，且差异具有统计学意义。

图5 SLC22A11表达水平降低与BRCA患者预后不良显著相关Fig.5 Decrease of SLC22A11 expression level is significantly associated with poor prognosis in patients with BRCA

2.5 SLC22A11可能参与BRCA进展的机制 利用GSEA探究SLC22A11可能参与BRCA进展的机制，发现MAPK信号通路、细胞因子与细胞因子相互作用、ABC转运蛋白、JAK STAT信号通路、VEGF信号通路、MTOR信号通路、Calcium信号通路等显著富集于SLC22A11高表达组（表2、图6）。

图6 SLC22A11可能参与BRCA进展的机制Fig.6 Mechanism by which SLC22A11 may participate in progress of BRCA

表2 SLC22A11可能参与BRCA进展的机制Tab.2 Mechanism by which SLC22A11 may participate in progress of BRCA

2.6 SLC22A11表达水平与BRCA免疫细胞浸润相关 在TIMER数据库中，SLC22A11表达水平与BRCA免疫细胞浸润相关（图7）。详细地说，SLC22A11表达水平与BRCA、BRCA亚型Basal-like型和luminal型免疫纯度相关。SLC22A11表达水平与BRCA B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞水平相关；SLC22A11表达水平与Basal-like型巨噬细胞水平相关；SLC22A11表达水平与luminal CD8+T细胞、CD4+T细胞和树突状细胞水平相关。

图7 SLC22A11表达水平与BRCA免疫细胞浸润水平相关Fig.7 Expression level of SLC22A11 is related to level of BRCA immune cell infiltration

此外，本文探究了SLC22A11表达水平与BRCA B细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞标志物间的关系。在非肿瘤纯度条件下，SLC22A11表达水平与BRCA CD8+T细胞标志物（CD8A、CD8B）、T细胞标志物（CD3D、CD3E、CD2）、B细胞标志物（CD19、CD79A）、Th1细胞标志物（TBX21、STAT4、IFNG）、Th2细胞标志物（STAT6、STAT5A、IL13）、Tfh细胞标志物（BCL6、IL21）、Th17细胞标志物（STAT3）、Treg细胞标志物（FOXP3、STAT5B、TGFB1）和T细胞衰竭标志物（PDCD1、CTLA4、GZMB）有关，且具有统计学意义（图8、表3）。在肿瘤纯度条件下，SLC22A11表达水平与BRCA CD8+T细胞标志物（CD8A、CD8B）、T细胞标志物（CD3D、CD3E）、B细胞标志物（CD19、CD79A）、Th1细胞标志物（TBX21、STAT4、STAT1、IFNG、TNF）、Th2细胞标志物（GATA3、STAT6、STAT5A）、Tfh细胞标志物（BCL6）、Th17细胞标志物（STAT3、IL17A）、Treg细胞标志物（FOXP3、CCR8、STAT5B、TGFB1）和T细胞衰竭标志物（PDCD1、LAG3、HAVCR2）有关，且差异具有统计学意义（图9、表3）。

图9 肿瘤纯度条件下SLC22A11表达水平与BRCA免疫细胞浸润标志物水平相关Fig.9 Expression level of SLC22A11 is related to level of BRCA immune cell infiltration markers under the condition of tumor purity

表3 SLC22A11表达水平与BRCA免疫浸润细胞标志物 水平相关Tab.3 Expression level of SLC22A11 is related to level of BRCA immune infiltrating cell markers

图8 肿瘤非纯度条件下SLC22A11表达水平与BRCA免疫细胞浸润标志物水平相关Fig.8 Expression level of SLC22A11 is related to level of BRCA immune cell infiltration markers under the condition of tumor impurity

此外，SLC22A11表达水平与Basal型和luminal型BRCA免疫细胞标志物显著相关（表4、表5）。详细地说，SLC22A11表达水平与Basal型免疫细胞标志 物TGFB1、CD79A、CD19、STAT4等 显 著 相 关 （表4）。SLC22A11表达水平与luminal型免疫细胞标志物CD19、STAT5B、CD8B、CD79A、CD8A、STAT4、PDCD1、CD3E、STAT5A、TBX21、CD3D、CD2、GZMB、IL13、STAT6、IL21和STAT3等显著相关（表5）。

表4 SLC22A11表达水平与BRCA Basal型免疫浸润细胞标志物水平相关Tab.4 Expression level of SLC22A11 is related to level of markers of BRCA Basal-type immune infiltrating cells

表5 SLC22A11表达水平与BRCA luminal型免疫浸润 细胞标志物水平相关Tab.5 Expression level of SLC22A11 is related to level of markers of BRCA luminal-type immune infiltrating cells

3 讨论

SLC家族成员有65个，在癌症进展中以癌基因或抑癌基因发挥生物学作用，并可能为人类疾病提供新的治疗靶标［13］。例如SLCO4A1在CRC组织中过表达。SLCO4A1过表达和T分期是CRC患者预后不良的独立危险因素。Kaplan-Meier生存分析发现SLCO4A1表达升高的患者预后更差。细胞水平上发现，干扰SLCO4A1表达能降低肿瘤细胞活力、侵袭、迁移和致癌能力［14］。SLC3A2在乳腺癌组织中表达水平显著升高，SLC3A2表达水平升高与乳腺癌高分级和NPI密切相关。SLC3A2蛋白表达水平是乳腺癌特异性生存期的独立危险因素［15］。近年研究发现SLC22A11在胰腺癌组织中低表达。SLC22A11表达水平降低与胰腺癌转移相关［7］。初步表明SLC22A11在胰腺癌中以抑癌因子发挥生物学功能，本文结果也证实SLC22A11在胰腺癌组织中表达降低。此外，本研究发现SLC22A11在乳腺癌及其亚型组织中表达水平降低，而SLC22A11甲基化水平显著升高。SLC22A11表达水平与BRCA患者种族、性别、年龄、组织学亚型、Menopause状态、淋巴结转移和TP53突变相关。SLC22A11甲基化水平与BRCA患者种族、年龄、淋巴结转移和TP53突变相关。提高SLC22A11表达水平与BRCA患者OS和RFS显著相关。提示SLC22A11在BRCA进展中是以抑癌基因的因素发挥作用，有望成为BRCA患者预后生物标志物和治疗的新靶点。

在BRCA进展过程中会出现基因异常表达，还会出现信号机制的异常激活或失调。本研究利用GSEA发现SLC22A11可能通过MAPK信号通路、ABC转运蛋白、JAK STAT信号通路、VEGF信号通路、MTOR信号通路、细胞因子与细胞因子受体相互作用等参与调控BRCA进展。研究报道MAPK信号通路、JAK STAT信号通路、VEGF信号通路、MTOR信号通路、ABC转运蛋白、细胞因子与细胞因子受体相互作用是影响乳腺癌进展和患者预后的重要调节 机 制［11，14，16-19］。目前有 研究报道SLC分子与MAPK、MTOR、JAK STAT、细胞因子等信号机制调节有关［19-22］。例如，SLCO2A1过表达可诱导肺癌细胞侵袭。干扰SLCO2A1表达可抑制细胞侵袭，诱导细胞凋亡。SLCO2A1影响PICO3/AKT/mTOR信号通路中p-mTOR、p-AKT和p-S6蛋白表达水平［19］。与对照组相比，干扰SLC7A2表达的小鼠中促炎细胞因子/趋化因子IL-1β、CXCL1、CXCL5、IL-3、CXCL2、CCL3和CCL4表达水平升高，IL-4、CXCL9和CXCL10表达水平降低［21］。SLC转运蛋白抑制剂可消除NaHCO3促进炎症基因表达的作用，JAK抑制剂能抵消NaHCO3介导的活化作用［22］。表明溶质载体家族成员SLC在细胞因子与细胞因子相互作用、MTOR、JAK STAT等信号机制中具有重要的调节作用，提示SLC22A11可能通过这些机制影响BRCA进展。

此外，BRCA进展还与肿瘤免疫微环境相关［23-24］。肿瘤纯度与癌症患者预后不良显著相关［25］。本研究发现SLC22A11表达水平与BRCA、Basal-like型和luminal型肿瘤纯度相关。另外，SLC22A11表达水平与BRCA B细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞水平相关。在非肿瘤纯度条件下，SLC22A11表达水平与免疫浸润细胞标志物CD8A、CD8B、CD3D、CD3E、CD19、CD79A、TBX21表达水平等显著相关。在肿瘤纯度条件下，SLC22A11表达水平与免疫浸润细胞标志物CD8A、CD8B、CD3D、CD3E、CD19、CD79A、TBX21、STAT4、STAT1、IFNG表达水平等显著相关，且差异具有统计学意义。在BRCA亚型Basal和luminal中，SLC22A11表达水平与免疫细胞标志物CD79A、CD19、STAT4表达水平等显著相关。研究报道，提高SCL家族成员SLC18A1表达与肺腺癌患者生存期相关，而与肺鳞癌患者生存期无关，且与癌症免疫相关［26］。SLC7A2能调节免疫相关因子G-CSF、TNF-α、IL-1α、IL-1β、CXCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CXCL2、CCL5等表达水平［27］。初步说明SLC成员在癌症免疫中具有重要功能。

本研究利用的数据库种类多，数据样本大，但仍需收集BRCA患者组织标本检测SLC22A11及免疫细胞标志物的表达水平，并通过高通量测序检测组织样本中免疫细胞水平以分析SLC22A11表达水平与BRCA免疫细胞浸润及其标志物水平间的关系。本研究初步发现SLC22A11在BRCA及其亚型组织中的表达水平显著降低，上调SLC22A11表达水平有望改善BRCA患者预后。SLC22A11表达水平与BRCA免疫细胞浸润和细胞标志分子水平显著相关，提示SLC22A11有望成为BRCA治疗的新靶点。