双氢青蒿素对非细菌性慢性前列腺炎模型大鼠前列腺组织凋亡、自噬 及纤维化的影响①

王军浩 周 岩 韩建鹏 杜 菲 冯建勇 郭 阔 陈文彬 李永章 （河北省中医院，石家庄 050011）

非细菌性慢性前列腺炎（chronic nonbacterial prostatitis，CNP）是慢性前列腺炎最常见的类型，病因复杂、诊断困难、反复发作、治疗效果不佳，甚至可导致男性性功能障碍及不育，对患者身心健康造成较大负面影响［1-2］。双氢青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素被硼氢化钠还原后的衍生物，不仅具有治疗疟疾、抗肿瘤作用，还对炎症引发的肺组织纤维化具有抑制作用［3-6］。但DHA是否影响CNP前列腺组织凋亡、自噬及纤维化尚不清楚。本研究以健康雄性SPF级SD大鼠复制CNP模型，观察DHA对CNP模型大鼠前列腺组织凋亡、自噬及其纤维化的影响，为CNP治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性SPF级SD大鼠36只，6周龄，体质量180～200 g，购于成都达硕生物有限公司［SCXK（川）2020-030］。

1.1.2 试剂 前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA） ELISA试剂盒购自R&D公司；IFN-γ、IL-4和COX2引物序列由上海生工生物公司合成；兔单克隆抗体TGF-β1（ab215715）、兔多克隆抗体CTGF抗体（ab125943）、兔多克隆抗体Cleaved-caspase-3（ab49822）、兔多克隆抗体Cleaved-caspase-9（ab2324）、兔单克隆抗体Beclin-1（ab210498）、兔单克隆抗体LC3B（ab192890）均购自Abcam公司； Masson染色试剂盒购自南京建城生物工程研究所；MK 3全波长酶标仪购自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 分组 36只健康雄性SPF级SD大鼠放入鼠笼中适应性饲养3 d，随机取6只作为空白组，剩余30只手术构建CNP模型，空白组实行假手术。CNP模型建立后，随机分为4组：模型组、40 mg/kg DHA组、20 mg/kg DHA组和前列康（QLK）组，每组6只。两个DHA组分别每天灌胃40、20 mg/kg DHA，QLK组每天灌胃0.5 g/kg前列康片，连续治疗1个月。空白组和模型组不采取治疗，每日灌胃等量生理盐水。

1.2.2 CNP模型建立 造模前12 h大鼠禁食不禁水饲养，造模开始时按30 mg/kg腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，大鼠完全昏迷后固定，剔除腹部全部毛发，消毒。无菌条件下在腹中线位置开口，将两侧睾丸分别挤出阴囊，结扎后剪断精索血管，缝合消毒后将大鼠放入鼠笼中等待苏醒。第2天在腹部皮下注射苯甲酸雌二醇0.35 mg/kg（溶于橄榄油）， 1次/d，连续20 d。每天用碘伏擦拭伤口并肌内注射青霉素（200 000 U/kg），注射1周。空白组行假手术处理，除不挤出阴囊和剪断精索血管外，其余操作同CNP造模。

1.2.3 ELISA 将前列腺组织制备成匀浆，ELISA试剂盒测定前列腺组织PSA含量，按照试剂盒说明书操作。

1.2.4 白细胞数检测 称取100 mg大鼠相同部位前列腺组织，加入400 μl无菌0.9%氯化钠溶液研磨制成匀浆液，加入0.78 ml白细胞稀释液，混匀，吸取10 μl混合液滴至白细胞计数池，静置2～3 min，显微镜下计数四角处4个大方格内白细胞总数。WBC（109L-1）=4个大方格内白细胞数/4×稀释倍数×10。

1.2.5 RT-qPCR TRlzol法提取前列腺组织总RNA，反转录成cDNA，RT-PCR检测前列腺组织IFN-γ、IL-4和COX2 mRNA表达，以β-actin为内参，引物序列见表1。定量PCR扩增程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性12 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，40个循环，72 ℃延伸5 min。2-ΔΔCt计算目的基因相对表达。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR

1.2.6 IHC检测 石蜡切片常规脱蜡至水，加入3%H2O2浸泡10 min，蒸馏水洗涤3次，加入缓冲液蒸煮3 min，重复2次，使抗原位点暴露。冷却至室温后水洗2次，PBS清洗2次，滴加5%BSA封闭液37 ℃封闭30 min，吸干多余液体，分别滴加一抗TGF-β1（1∶500）、CTGF（1∶200） 4 ℃过夜，滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG多抗室温孵育30 min，PBS清洗3次，滴加1%SABC 37 ℃孵育30 min，PBS清洗 3次，5 min/次，DAB显色，苏木精复染，脱水，封片， Image-Pro Plus光密度扫描处理，计算各标本积分光密度（integral optical density，IOD）与面积，平均光密度（AOD）=IOD/面积。

1.2.7 Masson染色 石蜡切片脱蜡至水，Weigert氏铁苏木素染色5 min，水洗后加入1%盐酸乙醇分化数秒，水洗，Masson蓝化液返蓝，水洗，丽春红染色5 min，漂洗后磷钼酸处理1 min，苯胺蓝液复染 2 min，1%冰醋酸处理1 min，脱水，封片，镜检，采用Image-Pro Plus进行光密度扫描处理。胶原纤维、黏液呈蓝色；肌纤维、纤维素和红细胞呈红色；细胞核呈蓝黑色。

1.2.8 TUNEL染色 按照试剂盒说明进行TUNEL染色：石蜡切片常规脱蜡至水，Proteinase K工作液（20 μg/ml）处理20 min，加入含2%过氧化氢的PBS室温反应5 min，PBS漂洗2次，干燥后加入50 μl TUNEL反应混合液，暗湿盒中反应1 h（37 ℃），终止反应，PBS漂洗3次，载液覆盖，488 nm激发光照射下观察细胞凋亡情况。

1.2.9 Western blot 提取前列腺组织总蛋白，BCA测定蛋白浓度，等量蛋白上样，SDS-PAGE凝胶电泳后转至PVDF膜，脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗（Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9和 Beclin-1 1∶1 000稀释，LC3 1∶2 000稀释） 4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，加入二抗37 ℃孵育1 h，ECL显影，Bio-Rad全功能成像系统采集图像，Image-Pro Plus分析光密度，以β-actin为内参，计算各组蛋白相对表达。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行统计学分析，结果用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐性两组间比较采用LSD分析，方差不齐时，两组间比较采用Tamhane's分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DHA对CNP大鼠前列腺PSA的影响 ELISA结果显示，与空白组相比，模型组大鼠PSA水平显著升高；与模型组相比，20、40 mg/kg DHA及QLK组CNP大鼠前列腺组织PSA水平下调，40 mg/kg DHA PSA抑制效果最好（表2）。

表2 前列腺组织PSA水平（±s）Tab.2 PSA level in prostate tissue （±s）

表2 前列腺组织PSA水平（±s）Tab.2 PSA level in prostate tissue （±s）

Note：1）P＜0.001 vs blank group； 2）P＜0.01 vs model group.

2.2 DHA对CNP大鼠前列腺组织白细胞数量的影响 镜检结果表明，与空白组相比，模型组大鼠前列腺组织中白细胞数显著增加，经20、40 mg/kg DHA及QLK治疗后，CNP大鼠前列腺组织白细胞数显著减少，40 mg/kg DHA效果最好（表3）。

表3 DHA对CNP大鼠前列腺组织白细胞数的影响（±s）Tab.3 Effect of DHA on white blood cell count in prostate tissue （±s）

表3 DHA对CNP大鼠前列腺组织白细胞数的影响（±s）Tab.3 Effect of DHA on white blood cell count in prostate tissue （±s）

Note：1）P＜0.05 vs blank group； 2）P＜0.05 vs model group.

2.3 DHA对CNP大鼠前列腺组织炎症因子的影响 RT-qPCR结果表明，与空白组相比，模型组大鼠前列腺组织促炎因子IFN-γ和COX-2表达增加，而抗炎因子IL-4表达降低；与模型组相比，40 mg/kgDHA组和QLK组IFN-γ和COX2 mRNA表达显著降低，IL-4 mRNA表达显著提高，40 mg/kg DHA组和QLK组炎症因子mRNA表达差异无统计学意义。虽然20 mg/kg DHA对CNP大鼠炎症因子IFN-γ和COX2 mRNA表达有下调作用，对IL-4 mRNA表达有上调作用，但差异无统计学意义（图1）。

图1 RT-qPCR检测大鼠前列腺组织炎症因子mRNA表达Fig.1 Inflammatory cytokines mRNA expressions in prostate tissue detected by RT-qPCR

2.4 DHA对CNP大鼠前列腺组织纤维化的影响 免疫组化结果显示，与空白组比较，模型组大鼠前列腺组织TGF-β1和CTGF分泌显著增加，20、 40 mg/kg DHA及QLK均能显著抑制CNP大鼠TGF-β1和CTGF分泌，与QLK相比，20 mg/kg DHA显著抑制TGF-β1分泌。Masson染色结果显示，与空白组相比，模型组大鼠前列腺胶原细胞面积百分比显著升高，20、40 mg/kg DHA及QLK显著降低了CNP大鼠前列腺胶原细胞面积百分比，20、40 mg/kg DHA与QLK作用差异显著（图2）。

图2 前列腺组织TGF-β1、CTGF免疫组化及Masson染色Fig.2 Immunohistochemistry and Masson staining of TGF-β1 and CTGF in prostate tissue

2.5 DHA对CNP大鼠前列腺组织细胞凋亡的影响 TUNEL染色结果显示，与空白组相比，模型组大鼠前列腺组织细胞凋亡率显著升高，20、40 mg/kg DHA及QLK治疗后，细胞凋亡率显著降低，20、 40 mg/kg DHA组与QLK组差异有统计学意义， 40 mg/kg DHA组变化最为显著（图3A）。Western blot结果表明，20、40 mg/kg DHA均显著抑制CNP大鼠前列腺组织Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9蛋白表达（图3B）。

图3 DHA对CNP模型大鼠前列腺组织细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of DHA on cell apoptosis of prostate tissues in CNP model rats

2.6 DHA对CNP大鼠前列腺组织自噬的影响 Western blot结果表明，CNP大鼠前列腺组织 Beclin-1蛋白表达和LC3Ⅱ/Ⅰ较比空白组显著升高，表明CNP大鼠前列腺组织自噬作用增强。20、40 mg/kg DHA治疗后，CNP大鼠前列腺组织Beclin-1 蛋白表达和LC3Ⅱ/Ⅰ显著降低，表明20、40 mg/kg DHA均能抑制CNP大鼠前列腺组织自噬，见图4。

3 讨论

CNP是泌尿科门诊常见男科疾病之一，与男性不育、性功能障碍、前列腺增生和前列腺癌有关［7］。但CNP临床诊断标准及治疗方法均存在不足，研究CNP的发病机制及治疗方式对男性健康具有重要意义。DHA已被证明对多种炎症具有防治作用，包括肠炎、肺炎等，但DHA是否对CNP有防治作用尚不清楚。本研究旨在探讨DHA对CNP的抗炎作用，并探究DHA对CNP大鼠前列腺组织细胞凋亡及自噬的影响。

炎症因子在CNP发展过程中具有重要作用，且CNP会导致PSA水平升高，白细胞数增加［8-10］。本研究中，CNP大鼠前列腺组织PSA水平和白细胞数显著升高，促炎因子IFN-γ和COX2 mRNA表达显著增加，抑炎因子IL-4 mRNA表达显著降低，表明CNP模型构建成功，20、40 mg/kg DHA及QLK促使CNP大鼠前列腺组织PSA水平和白细胞数显著下降， 40 mg/kg DHA及QLK显著减少IFN-γ和COX2 mRNA表达及增加IL-4 mRNA表达，但20 mg/kg DHA对IFN-γ、COX2和IL-4 mRNA表达无显著影响，说明20 mg/kg DHA无法有效控制CNP炎症反应，而 40 mg/kg DHA和QLK可有效抑制CNP炎症反应。

组织纤维化通常是各种刺激诱导慢性炎症反应的最终结果，是炎症引发的异常伤口愈合过程，主要产生大部分胶原的肌成纤维细胞过度聚集与活化，过度纤维化可导致器官功能退化、衰竭甚至死亡［11-12］。研究表明，TGF-β1/CTGF信号通路介导了CNP病理形态，是纤维化发生机制的主要通路之一［11，13］。本研究也显示CNP大鼠前列腺组织TGF-β1/CTGF信号通路激活，发生病理性纤维化。而20、 40 mg/kg DHA及QLK均显著降低了CNP大鼠前列腺组织TGF-β1、CTGF分泌和胶原细胞面积百分比，表明20、40 mg/kg DHA及QLK均能抑制TGF-β1/CTGF信号通路，减轻CNP大鼠前列腺组织纤维化程度。与QLK相比，20、40 mg/kg DHA均能显著降低CNP大鼠前列腺组织纤维化程度，20 mg/kg DHA还显著抑制了TGF-β1分泌，表明DHA比QLK抗纤维化活性更强，而20 mg/kg可能是DHA抗纤维化的最佳用药剂量。

细胞凋亡是一种稳态且非裂解的细胞死亡模式，可支持旧细胞和受损细胞协调性拆除和清除［14］。研究表明，细胞凋亡可促进炎症发展，因此减少细胞凋亡可能有利于减轻炎症反应［15］。KANG等［16］研究表明，CNP大鼠前列腺组织细胞大量凋亡，而红参具有明显抗凋亡和抗炎作用。本研究显示，CNP大鼠前列腺组织细胞大量凋亡，与KANG等［16］结果一致，而20、40 mg/kg DHA及QLK均能显著抑制CNP大鼠前列腺组织细胞凋亡，与QLK相比，20、40 mg/kg DHA均能显著抑制前列腺组织细胞凋亡，表明DHA比QLK抗细胞凋亡能力更强。caspase-3和caspase-9分别是调节细胞凋亡的启动子和效应子，Cleaved-caspase是caspase的活化状态，表明细胞凋亡被激活［15］。Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9蛋白Western blot结果表明，20、40 mg/kg DHA均能显著抑制caspase-3和caspase-9蛋白活化，从而抑制前列腺组织细胞凋亡。

基础自噬水平可确保衰老和/或受损细胞器生理更新，维持应激因素后细胞存活［17］。自噬比细胞凋亡更早，位于凋亡上游，自噬过度激活可能通过不受控制的降解过程导致细胞凋亡［17-18］。而细胞自噬受细胞因子调节，一般认为Th1细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ是自噬诱导因子，而Th2细胞因子IL-4、 IL-5、IL-6、IL-10、IL-13和抗炎细胞因子是自噬抑制因子，过度自噬会引起炎症反应［19］。本研究中，CNP大鼠前列腺组织Beclin-1蛋白表达和LC3Ⅱ/Ⅰ显著升高，表明CNP大鼠前列腺组织自噬作增强，而20、40 mg/kg DHA均能显著抑制CNP大鼠前列腺组织Beclin-1蛋白分泌和降低LC3Ⅱ/Ⅰ，表明DHA能显著抑制CNP大鼠前列腺组织自噬，减轻CNP细胞凋亡和炎症反应。

综上，DHA对CNP具有显著抗炎和抗纤维化活性，可抑制CNP大鼠前列腺组织细胞凋亡和自噬，减轻CNP炎症反应。本研究中40 mg/kg DHA表现出了较好的抗炎作用，而20 mg/kg DHA不能有效控制CNP炎症反应，但抗纤维化作用最强，因此DHA治疗CNP的有效浓度及功效还需进一步研究。