香青兰提取物治疗溃疡性结肠炎的网络药理学分析*

彭韵志 ，白文慧 ，陈张军，于 慧，靳 敏，胡 海，王占黎

(1.包头医学院研究生院，内蒙古 包头 014040;2.包头医学院基础医学与法医学院;3.内蒙古自治区疾病相关生物标志物重点实验室)

香青兰(Dracocephalum moldavica L.)是唇形科植物，广泛应用于中国传统民族医学，其主要成分有黄酮类、糖类、苯丙素类、三萜、甾体、挥发油以及微量元素等[1-6]。香青兰全草中黄酮类化合物含量约为1.90 %，主要有洋芹素、木犀草素、金合欢素、桅子素乙、玄参黄酮、鼠尾草素、异鼠李素、田蓟苷、藿香苷、山柰酚以及日本椴苷等[7-9]。香青兰提取物具有良好的抗氧化、抗炎特性，可有效治疗多种疾病。此外，黄酮类化合物可用作天然预防性治疗，在缓解肠道炎症、肠道屏障受损和菌群失调等方面起作用[10]。

随着信息时代的发展，以系统生物学、生物信息学和高通量为基础，集药理学和信息网络于一体的网络药理学正在蓬勃发展，通过网络药理学可以直接从大量数据中识别药物和疾病靶点，了解它们之间的机制和通路[11-12]。中草药具有多成分、多靶点的特点，是中医治疗疾病的有效手段，但由于其成分复杂，有效成分和不良反应尚不明确，限制了中草药的应用。因此，结合网络药理学方法探讨中草药治疗疾病的作用机制有益于中草药的有效应用。

1 资料与方法

1.1香青兰提取物活性成分探索 在Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)依次检索木犀草素(Luteolin)、熊果酸(Ursolic acid)、芹菜素(Apigenin)、山奈酚(Kaempferol)、金合欢素(Acacetin)、齐墩果酸(Oleanic acid)、迷迭香酸(Rosmarinicacid)等，通过UniProt(https://www.uniprot.org/)将相关靶点的基因名标准化[13]。

1.2溃疡性结肠炎相关靶点的获取 溃疡性结肠炎的相关靶点通过OMIM(https://omim.org/)、DisGeNET(https://www.disgenet.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库检索并使用UniProt将相关靶点的基因名标准化。利用韦恩图(https://www.omicshare.com/tools/)将香青兰提取物成分靶点和溃疡性结肠炎疾病靶点对比分析，交集靶点即为香青兰提取物治疗溃疡性结肠炎的潜在作用靶点。

1.3蛋白质相互作用网络图构建和生物学功能注释 通过STRING 11.0(https://string-db.org/)数据库构建蛋白质互作网络(Protein-Protein Interaction Network,PPI)图[14]。参数设置为：物种仅限于Homo sapiens，相关度大于0.700[15]。通过CytoScape 3.6.0构建PPI网络图。利用MCODE算法对蛋白质群进行生物学功能注释。

1.4富集分析 通过DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对香青兰提取物治疗溃疡性结肠炎的潜在靶基因进行GO富集分析和KEGG通路分析[16]。物种限定为Homo sapiens，注释的意义参考P<0.05。

2 结果

2.1香青兰提取物活性成分筛选 利用Pubchem搜索化合物信息，得到香青兰提取化合物的1 596个蛋白质靶点，经过高可能性筛选和重叠消除后，共获得537个成分靶点。如表1所示，单个化合物与多个靶点相关，说明药物具有多成分、多靶点协同作用的特点。

表1 靶点网络根据连接度的成分排序

2.2疾病靶点及药物治疗溃疡性结肠炎的潜在靶点的获取 通过检索OMIM、DisGeNET、GeneCards疾病靶点数据库，本研究共获得了1 458个香青兰提取物活性成分靶点，537个疾病靶点。如图1所示，将药物成分靶点与疾病靶点进行交集，共获得172个香青兰提取物活性成分治疗溃疡性结肠炎的潜在作用靶点。

图1 香青兰提取物活性成分靶点和溃疡性结肠炎相关疾病靶点的韦恩图

2.3PPI网络分析 图2为172个潜在蛋白靶点的 PPI 网络图。疾病靶点 PPI 网络图(交互分数≥0.700)，包含172个节点和1 598条边。Average node degree为18.6，avg.local clustering coefficient为0.532，PPI enrichment p-value<1.0e-16，表明所选蛋白之间的相互作用比从基因组中随机抽取的一组相似大小的蛋白质有更多的交互作用，因此，所选蛋白质作为一个整体具有生物学意义。

图2 蛋白质互作网络分析

随后进行高度中心靶点的筛选。PPI网络拓扑分析基于“度(Degree)”“介度中心度(Closeness)”“接近中心度(Betweenness)”3大网络参数，用于选择中位数以上节点作为关键靶点，构建药物对疾病治疗效果的中心节点。第一次筛选条件设定为degree≥18、closeness≥0.35、betweenness≥0.01、交互分数≥0.700，得到33个中心节点和230条边。然后进一步筛选了33个关键靶点，设定条件为degree≥44、closeness≥0.390、betweenness≥0.030 5、交互分数≥0.700，得到10个中心节点和21条边。在网络中，节点与其他多个边缘交互PPI中相互作用排前10的靶基因如表2所示，被认为是关键治疗靶点。

表2 蛋白质互作靶基因排序

利用MCODE算法对蛋白质群进行生物学功能注释，识别出其主要功能子簇，如图3所示。由图3可得，香青兰提取物治疗溃疡性结肠炎潜在靶点的主要功能子簇有6个，分别由增殖细胞核抗原(PCNA)、上皮生长因子细胞增殖和信号传导的酪氨酸激酶型受体(EGFR)、酪氨酸激酶受体2(ERBB2)、周期素依赖性激酶抑制因子1A(CDKN1A)等85个靶点蛋白组成，提示香青兰提取物治疗溃疡性结肠炎可能主要经由这些靶点的相互作用，因此将这85个靶点记录为核心靶点。

图3 利用MCODE算法分析蛋白质群

2.4GO功能富集分析 利用DAVID数据库对172个交集靶点进行GO分析。共有89个生物过程(BP)、12个细胞成分(CC)和40个分子功能(MF)，分别符合基因计数≥2和P<0.05的要求。如图4所示为GO富集分析分别展示生物学过程、细胞成分和分子功能的前11项。结果发现交集靶点涉及转录的正调控DNA模板化(Positive regulation of transcription,DNA-templated)、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控(Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、细胞对白细胞介素1的反应(Cellular response to interleukin-1)、类固醇代谢过程(Steroid metabolic process)、对肿瘤坏死因子的细胞反应(Cellular response to tumor necrosis factor)等生物学过程；富集在小窝(Caveola)、内质网膜(Endoplasmic reticulum membrane)、I-kappaB/NF-kappaB复合体(I-kappaB/NF-kappaB complex)、转录因子复合体(Transcription factor complex)、蛋白质细胞外基质(Proteinaceous extracellular matrix)等细胞成分；参与转录因子结合(Transcription factor binding)、血红素结合(Heme binding)氧化还原酶活性、作用于成对供体结合或还原分子氧(Oxidoreductase activity,acting on paired donors,with incorporation or reduction of molecular oxygen)、氧结合(Oxygen binding)、类固醇羟化酶活性(Steroid hydroxylase activity)等分子功能。

图4 GO富集分析

2.5KEGG通路富集分析 为了进一步揭示香青兰提取物治疗溃疡性结肠炎相关信号通路的作用机制，对相关靶点进行了KEGG通路富集分析。KEGG富集分析共获得205条通路(P<0.01)，与癌症、免疫和炎症等密切相关。如图5所示，按照P值从小到大的顺序列出了前20条通路，如，大肠癌(colorectal cancer，CRC)和炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)涉及消化系统，T 细胞受体信号通路(T cell receptor signaling pathway)和Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)参与免疫系统反应，肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、NOD样受体信号通路(NOD-like receptor signaling pathway)和HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)涉及炎症反应。此外，本研究还发现了FoxO信号通路(FoxO signaling pathway)、催乳激素信号通路(Prolactin signaling pathway)。

图5 KEGG通路富集分析

3 讨论

3.1香青兰提取物活性成分筛选 长期使用抗炎或免疫抑制药物具有疗效和安全的局限性，中草药已被广泛应用于改善胃肠功能障碍和调节免疫炎症反应[17]。经典的中草药已被用作溃疡性结肠炎的潜在治疗药物，其中，黄酮类化合物和多酚类化合物已被应用于缓解溃疡性结肠炎的临床实践[18-19]。香青兰提取物的活性成分有多种药理作用，可以改善肠腔环境并维持免疫平衡。Li等[20]证实木犀草素的治疗显著缓解了溃疡性结肠炎大鼠的结肠损伤。据报道，熊果酸(ursolic acid)可以通过肠道菌群和脂肪酸代谢影响免疫细胞浸润和细胞因子表达，对葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型起到保护和治疗作用[21]。

3.2潜在靶点的PPI网络分析 本实验整理的30个活性成分主要作用于172个溃疡性结肠炎疾病靶点，单个化合物与多个靶点相关，体现了药物多成分、多靶点的协同作用。PPI分析表明，172个相关靶点具有生物相关性。PPI网络分析发现，靶基因主要集中在Signaling by Interleukins、Cytokine Signaling in immune system和Inflammatory response。有研究证实，IL23/IL17轴可以促进Th17细胞分化，进而产生促炎因子白介素-17(IL-17)，这在溃疡性结肠炎发病机制中起关键作用[22]。据报道，溃疡性结肠炎的发病机制包括多种肠道相关的免疫炎症途径，包括上皮屏障、共生菌群、抗原识别以及免疫反应失调等[23]。

3.3通路富集分析 KEGG通路富集分析表明香青兰提取物治疗溃疡性结肠炎时涉及消化、免疫系统反应和炎症反应的相关通路，能够调节T 细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、NOD样受体信号通路和HIF-1信号通路。T 细胞受体信号通路和Toll样受体信号通路可以调节机体肠道稳态[24-26]。肿瘤坏死因子信号通路、NOD样受体信号通路和HIF-1信号通路能够调节机体炎症反应[27-30]。同时，已有研究指出FoxO信号通路有助于维持和修复上皮屏障[31- 32]。本研究的结果也富集到了该通路，解释了香青兰提取物可以修复肠屏障的作用机制。

综上所述，香青兰提取物中活性成分具有多种生物学功能，可作用于多条炎症、免疫及癌症相关通路，具有多成分、多靶点协同作用的特点。