水稻田原位富集柠檬酸杆菌关键影响因子的优化

李一路， 程 伟， 张 敏， 郭照辉， 王玉双， 魏小武， 伍善东， 单世平

(湖南省微生物研究院， 湖南 长沙 410009)

0 引言

【研究意义】硫酸盐还原细菌(Sulfate-reducing bacterium)是一类厌氧或兼性厌氧菌，广泛分布于土壤、湖泊和海洋中。硫酸盐还原细菌能够利用硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐甚至元素硫作为电子受体，参与自然界中元素硫的循环，产生的硫化物可以与重金属结合形成沉淀，从而达到钝化重金属的目的[1-2]。柠檬酸杆菌是一类非传统的硫酸盐还原细菌，具有硫酸盐还原活性，在厌氧和微氧环境下均可还原硫酸盐[3-4]。利用微生物进行重金属污染土壤的原位修复，关键是目标菌株在土壤中的定殖和富集。目前通常是采取菌株液体发酵培养，然后向土壤中接种发酵菌悬液[5]。作为土壤中的非土著优势菌群，将发酵培养的菌液直接加入土壤，其存活率并不确定。因此，探明柠檬酸杆菌原位富集的关键影响因子，并通过调整土壤中的理化因子来提高原位富集土壤中的柠檬酸杆菌，对利用柠檬酸杆菌进行镉污染稻田的原位修复具有重要的现实意义。【前人研究进展】目前，柠檬酸杆菌被广泛用于废水处理，如WANG等[6]筛选出1株柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)JPG1，可以有效去除废水中的铜离子。杨晶[7]采用柠檬酸杆菌吸附重金属镉(Cd)。周玉杰[8]通过包埋柠檬酸杆菌有效去除废水中的萘、菲。湖南省微生物研究院植物保护课题组从Cd污染土壤中分离出柠檬酸杆菌菌株XT1-2-2，能钝化土壤中的Cd，降低水稻对Cd的吸收[9]。【研究切入点】目前，利用微生物原位修复土壤重金属污染基本上在实验室阶段，大田应用和产品生产方面相对薄弱，而通过调整土壤理化因子高效富集具有钝化重金属功能的微生物的研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】以柠檬酸杆菌菌株XT1-2-2为目标菌株，通过单因子和正交试验，考察碳源、硫源、亚铁离子和有机质对土壤pH、菌株XT1-2-2数量、硫酸盐还原活性(SRA)以及土壤有效镉含量的影响，以期找到原位富集XT1-2-2的关键影响因子及最优配比，为今后采用菌株XT1-2-2修复重金属污染土壤提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用土壤采集于益阳水稻试验田，去除明显的碎石、有机残留物，风干粉碎后过20目筛，称重100 g装于三角瓶中，125℃灭菌2次，每次2 h，加入适量的灭菌水混匀，保持土壤处于淹水状态，分别加入等量的XT1-2-2菌悬液，搅拌均匀，试验前对土壤中的XT1-2-2进行计数统计。

土壤基本理化性质为pH 5.98，总氮1.97 g/kg，总钾2.06 g/kg，总磷0.64 g/kg，碱解氮0.12 g/kg，速效钾20.9 g/kg，速效磷15.2 mg/kg，有机质23.1 mg/kg，全Cd含量0.47 mg/kg，菌株XT1-2-2数量2.0×105cfu/g。

1.2 试验方法

1.2.1 单因子试验 在装有土壤及菌株XT1-2-2的三角瓶内，分别加入不同碳源(乳酸钠、丙酸钠、乙酸钠、葡萄糖各2.0 g/kg)、不同硫源(硫酸钠、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、单质硫、硫酸钙、硫酸镁、硫酸钾、硫酸铵各2.0 g/kg)、不同有机质(统糠、草炭、稻壳炭、有机肥各15.0 g/kg)、不同浓度(1.0 g/kg、2.0 g/kg、4.0 g/kg、8.0 g/kg)亚铁离子作为试验组，以不加任何因子的土壤为对照，每处理3个重复。在处理10 d、20 d和30 d时测量土壤的pH、菌株XT1-2-2数量及SRA活性，并将30 d后的土壤晾干磨碎过20目筛后测有效镉含量。

1.2.2 正交试验 结合以上单因素影响因子对土壤中各项指标的影响，选取4种因素3个水平进行L9(34)正交试验，每组设置3个重复。30℃培养箱中静置30 d后进行土壤pH、菌株XT1-2-2数量、SRA以及土壤有效镉测定。

1.2.3 XT1-2-2菌数计数 通过硫酸盐还原菌测试瓶进行计数。采用绝迹稀释法，即用无菌注射器将待测定的水样逐级注入到测试瓶中进行接种稀释后，置于培养箱培养，根据测试瓶阳性反应和稀释的倍数，计算水样中细菌量总数。

1.2.4 土壤硫酸盐还原活性(SRA)的测定及计算 参考文献[10]的方法测定和计算水稻田土壤硫酸盐还原活性。

1.2.5 土壤中有效镉的测定 土壤晾干研磨过20目筛后，称取约0.1 g，用浓HNO3、HClO4和HF(体积比4︰2︰2)混合溶液在180℃高温板上消解2 h。待消解完全后，采用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS, Agilent-7500cx)测定Cd浓度。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2013进行数据处理及图表绘制，采用SPSS 25.0进行数据间差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同碳源处理水稻田土壤性质及菌株XT1-2-2的富集

从图1看出，土壤pH：大部分碳源的加入可以提高土壤pH，随着处理时间延长，添加有乳酸钠的土壤pH显著上升(P<0.05)，处理30 d，与CK相比，pH上升1.6个单位；乙酸钠和丙酸钠处理土壤30 d后pH分别较CK升高0.3个和0.2个单位。XT1-2-2菌数：与CK相比，添加乳酸钠10 d后，XT1-2-2菌数显著增加(P<0.05)2个数量级，其他处理与CK相比无明显差异；随着处理时间延长至20 d，添加乳酸钠处理的土壤XT1-2-2菌数稳定；丙酸钠处理的土壤XT1-2-2菌数增加，且显著高于CK(P<0.05)；处理30 d后，葡萄糖处理的土壤XT1-2-2菌数也显著高于对照(P<0.05)。SRA活性：在整个试验阶段，乳酸钠处理的土壤SRA活性均显著增加(P<0.05)；随着时间延长，丙酸钠和葡萄糖处理的土壤SRA活性上升，与XT1-2-2菌数的变化趋势一致。有效镉含量：不同碳源处理的土壤有效镉含量均显著低于CK(P<0.05)，乳酸钠、乙酸钠、丙酸钠和葡萄糖处理后土壤有效镉含量分别下降22.1%、13.3%、14.2%和16.1%。说明，碳源影响土壤中XT1-2-2菌富集，以乳酸钠的效果最明显，随时间延长，丙酸钠的影响程度逐渐加强。

注：小写字母表示相同时间下不同处理在P<0.05上差异显著，下同。

2.2 不同硫源处理水稻田土壤性质及菌株XT 1-2-2的富集

从图2看出，土壤pH：处理10 d后，所有硫源处理的土壤pH均低于CK，随着时间延长，土壤pH呈先降低后上升趋势，且除单质硫处理外，其他硫源处理的土壤pH均高于CK，其中硫酸钠和亚硫酸钠处理的土壤pH增幅最大。XT1-2-2菌数：处理10 d后，土壤中菌株XT1-2-2数量快速增至最大值，除硫酸钙和硫酸钾处理外，其他硫源处理的土壤菌株XT1-2-2数量均显著高于CK(P<0.05)，其中亚硫酸钠处理的土壤，菌数由2.5×105cfu/g增至1.1×107cfu/g，增加2个数量级，增幅最大；其次是硫代硫酸钠、单质硫和硫酸铵。随着处理时间延长，菌数均不同程度的减少，亚硫酸钠处理土壤后，菌株XT1-2-2均显著高于CK(P<0.05)。SRA活性：处理10 d后，所有硫源处理的SRA活性均显著高于CK(P<0.05)，但随时间延长，SRA活性有所降低，到处理30 d，仅亚硫酸钠和硫酸钾处理的土壤SRA显著高于对照(P<0.05)。有效镉含量：不同硫源处理土壤30 d后，与CK相比，土壤中有效镉含量均显著降低(P<0.05)，下降幅度为28%～32%。说明，硫源中亚硫酸钠对土壤中菌株XT1-2-2富集影响最大。

2.3 不同有机质处理水稻田土壤性质及菌株XT1-2-2的富集

从图3看出，土壤pH：与CK相比，处理10 d后，稻壳炭、草炭和有机肥对提高土壤的pH效果较好；处理20 d，除统糠外，各处理间的pH均接近7.0，差异不显著；处理30 d后，各处理的pH均升至7.5～7.6；添加有机质对提高土壤的pH效果不明显。XT1-2-2菌数：添加有机质处理土壤后，菌株XT1-2-2数量有变化，且各时间段变化不一致，处理前20 d，添加草炭、稻壳炭和统糠后，菌株XT1-2-2数量均高于CK，但处理30 d后，仅稻壳炭和有机肥处理的菌数增长明显，尤其是有机肥处理30 d后，XT1-2-2数量增加1个数量级。SRA活性：有机质对土壤中SRA活性的影响趋势跟菌株XT1-2-2数量变化一致。有效镉含量：添加有机质对降低土壤中有效镉含量效果显著，添加草炭、稻壳炭、统糠和有机肥处理30 d后，土壤中有效镉含量分别降低53%、49%、56%和52%。说明，有机质对土壤有效镉含量影响较大，综合pH、菌株XT1-2-2A菌数和SRA变化可考虑选择有机肥和草炭作为最佳有机质。

图3 不同有机质处理土壤的pH、XT1-2-2 菌数、SRA活性及有效镉含量

2.4 不同浓度亚铁离子处理水稻田土壤性质及菌株XT 1-2-2的富集

从图4看出，土壤pH：随着处理时间延长，各处理土壤pH均呈上升趋势，在处理30 d后，亚铁离子2.0 g/kg处理的土壤pH最高至7.7。XT1-2-2菌数：随着处理时间延长，菌株XT1-2-2数量均呈先上升后下降趋势，处理30 d后，4.0 g/kg的亚铁离子对XT1-2-2菌数影响最大。土壤SRA活性：处理前20 d，8.0 g/kg的亚铁离子处理土壤SRA活性最强；处理30 d，4.0g/kg的亚铁离子处理土壤SRA活性显著高于CK(P<0.05)。有效镉含量：添加1.0 g/kg、2.0 g/kg、4.0 g/kg和8.0 g/kg硫酸亚铁铵处理30 d后，土壤中有效镉含量分别降低56%、65%、71%和65%，与CK相比差异显著(P<0.05)。

图4 不同浓度亚铁离子处理土壤的pH、XT1-2-2 菌数、 SRA活性及有效镉含量

2.5 土壤中原位富集菌株XT 1-2-2不同影响因子及水平的正交试验

正交试验因素和水平见表1。从图5可看出影响土壤中原位富集菌株XT1-2-2各因素的主次顺序、最优水平及组合。对土壤pH而言，碳源是最主要的影响因素，各因素的主次顺序为A>B>D>C，最优组合为A2B1C3D3。这与单独碳源处理结果不同，单独碳源处理土壤30 d后，乳酸钠提升土壤pH效果最佳。但对比不同的因素组合，pH稳定在7.56～7.84。对菌株XT1-2-2数量和SRA来说，因素的主次顺序和最优水平具有一致性。硫源是最主要因素，各因素的主次为B>A>C>D，最优组合为A2B2C1D1。亚硫酸钠处理的土壤，其菌株XT1-2-2数量最多，硫酸盐还原活性也最大，与单独硫源处理的结果一致。对降低土壤有效镉影响最大的因素也是硫源，其次为有机质，各因素的主次为B>D>C>A，最优组合为A2(A3)B2C1(C2)D1。硫源是影响菌株XT1-2-2数量和SRA的最主要因素，同时也是影响有效镉含量的最主要因素，说明菌株XT1-2-2数量和SRA活性与土壤有效镉含量密切相关。综合分析，原位富集水稻中的菌株XT1-2-2数量关键因子强度顺序为硫源、碳源、亚铁离子、有机质。最佳富集因子组合为亚硫酸钠2 g/kg、丙酸钠2 g/kg、亚铁离子4 g/kg、草炭15 g/kg。

表1 土壤中原位富集硫酸盐还原菌 L9 (34) 正交试验因素及水平

图5 4种因素不同水平下土壤的 pH、菌株 XT 1-2-2的数量、 SRA活性以及土壤有效镉含量

3 讨论

柠檬酸杆菌菌株XT1-2-2来自Cd污染稻田土，具有硫酸盐还原活性[9]，可参与土壤中硫循环，其代谢产物可以与重金属离子络合成硫化物沉淀，在重金属污染修复方面发挥着重要作物[11]。探讨不同理化因子与土壤原位富集菌株XT1-2-2数量、还原活性乃至降Cd能力的关联，能够为今后进一步开展采用菌株XT1-2-2修复重金属污染土壤提供一定的技术支撑和方法。目前，关于具有硫酸盐还原特性菌株培养富集的研究多在液体发酵工艺上[12-13]。本研究模拟稻田土淹水环境，考察各因素对土壤pH、菌株XT1-2-2数量、SRA活性以及土壤有效镉含量的影响。单因子试验结果表明，碳源中乳酸钠的效果最优，丙酸钠其次；硫源中亚硫酸钠对提高土壤菌株XT1-2-2数量和SRA的效果最佳；有机质对土壤有效镉含量影响较大，可能是有机质本身对Cd有一定的吸附效果，综合pH、菌株XT1-2-2数量和SRA活性变化可以考虑选择有机肥和草炭作为最佳有机质；处理30 d后，4.0 g/kg的亚铁离子对土壤中菌株XT1-2-2数量和SRA的影响也最大，有效镉降低效果较好。正交试验结果表明，各因子组合间pH为7.56～7.84。影响土壤XT1-2-2菌数、SRA活性和有效镉含量的因素大致相同，影响最大的因素均为硫源中的亚硫酸钠。可能是因为该柠檬酸杆菌也具有亚硫酸盐还原酶[3]，能够还原亚硫酸盐，产生硫化氢，从而与土壤中的Cd离子结合生成难溶物CdS，进而降低土壤有效镉含量[14]，具体机理还有待进一步深入研究。

4 结论

原位富集稻田土中菌株XT1-2-2数量的关键因子强度顺序为硫源、碳源、亚铁离子、有机质。最佳富集因子组合为亚硫酸钠2 g/kg、丙酸钠2 g/kg、亚铁离子4 g/kg、草炭15 g/kg。该研究为采用柠檬酸杆菌菌株XT1-2-2进行土壤重金属修复提供了一定的理论支撑。