miR-135a和miR-135b表达水平在子宫内膜癌预后评估中的价值

王秋梅，全培青，刘晓庆，孙姗姗，江烨伶

复旦大学附属妇产科医院妇科，上海 200011

子宫内膜癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，其发病率呈逐年升高的趋势，严重威胁患者的健康和生命。子宫内膜癌早期一般没有明显症状，确诊时往往已经为中晚期，出现淋巴结转移和宫颈浸润等情况，预后较差，因此，寻找早期诊断和预后判断的指标具有重要的临床意义。微小RNA(miRNA)是非编码RNA核苷酸片段，与癌基因和抑癌基因的表达密切相关，对基因表达的调控，如癌细胞分化、增殖和凋亡具有重要作用，已经成为诊断癌症及预后判断的重要指标，尤其在预后判断方面得到了学者们的关注[1]。DONKERS等[2]的研究发现，子宫内膜癌与良性子宫内膜疾病患者血清miR-135a和miR-135b的表达存在明显差异，但是miR-135a和miR-135b是否能够成为子宫内膜癌的预后判断指标仍不清楚。本研究拟通过检测子宫内膜癌患者血清中的miR-135a和miR-135b表达水平，观察二者在子宫内膜癌预后判断中的临床价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年1月至2019年12月在本院接受子宫内膜癌手术的115例子宫内膜癌患者纳入子宫内膜癌组，年龄45～79岁，平均(62.83±12.63)岁；体质量指数(BMI)为(23.53±2.18)kg/m2；病理类型：子宫内膜样腺癌84例，黏液/浆液性腺癌31例；分化程度：中高分化70例，低分化45例；临床分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期56例，Ⅲ期23例和Ⅳ期15例。纳入标准：均符合子宫内膜癌的诊断标准，并经术后病理检查证实；首次手术切除；临床病历资料完整；术前未经过放化疗、内分泌和免疫治疗等。排除标准：合并其他部位恶性肿瘤；合并其他妇科疾病；合并免疫性疾病；存在智力下降或者精神性疾病。选择同期在本院体检健康的45例女性纳入对照组，年龄45～79岁，平均(62.19±11.62)岁;BMI为(23.19±2.07)kg/m2。两组研究对象年龄、BMI比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有研究对象均签署知情同意书，本研究经本院医学伦理委员会审核通过。

1.2方法

1.2.1标本采集 抽取所有研究对象入院或体检时肘静脉血5 mL于抗凝管中，以3 000 r/min离心10 min，将上清液放置于—70 ℃的冰箱中保存待测。

1.2.2实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR) 使用 mirVana miRNA 提取试剂盒提取标本中的总RNA，并使用 MagMAXTMmirVanaTMTotal RNA 分离试剂盒 (Thermo Fisher Scientific) 从血清中提取 RNA。根据说明书，使用 All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR 检测系统(GeneCopoeia,Rockville,MD,USA)进行反转录PCR和qRT-PCR，以确定 miR-135a 和miR-135b的表达水平。基于 miR-135b 的退火温度，采用 3 步法进行 qRT-PCR 检测 miRNA 表达。初始变性设定为 95 ℃，持续10 min，1个循环。变性步骤设置为95 ℃ 10 s，退火步骤设置为55 ℃ 20 s，延伸步骤设置为72 ℃ 15 s，共40个循环。 U6作为内部对照，miRNA的相对表达水平采用2—ΔΔCt法计算。引物序列：U6正向引物为5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物为5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；miR-135a正向引物为5′-AACCCTGCTCGCAGTATTTGAG-3′，反向引物为5′-GCGGCAGTATGGCTTTTTATTCC-3′；miR-135b正向引物为5′-GGGGTACCTCCTCTTCTTCACAATTTCTCTCAGTG-3′，反向引物为5′-GAAGATCTCAGTCACCTTTGAGGTCTGAG-CT-3′。

1.2.3随访 患者出院后，每两个月到医院门诊随访1次，对于不能到医院就诊的患者，有专人进行电话随访，并记录患者死亡、肿瘤复发和转移情况。复发、转移参照《子宫内膜癌诊断与治疗指南(2021年版)》[3]中的诊断标准。根据B超、CT和MRI进行盆腔肿块的检查，必要时进行肿块活组织检查。随访两年，出现死亡、肿瘤复发和转移判断为预后不良，无上述情况判断为预后良好。

1.2.4观察指标 比较子宫内膜癌组和对照组血清miR-135a和miR-135b表达水平；比较子宫内膜癌患者治疗前后血清miR-135a和miR-135b表达水平；比较不同临床特征和不同预后情况子宫内膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表达水平；分析血清miR-135a和miR-135b表达水平预测两年内子宫内膜癌患者出现预后不良的价值。分析子宫内膜癌患者血清miR-135a与miR-135b表达水平的相关性。

2 结 果

2.1两组血清miR-135a和miR-135b表达水平比较 入院时，子宫内膜癌组血清miR-135a表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义(t=10.734，P<0.001)；子宫内膜癌组术后7 d血清miR-135a表达水平较入院时明显升高，差异有统计学意义(t=13.930，P<0.001)。 入院时，子宫内膜癌组血清miR-135b表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(t=18.601，P<0.001)；子宫内膜癌组术后7 d血清miR-135b表达水平较入院时明显降低，差异有统计学意义(t=13.475，P<0.001)。见表1。

表1 两组血清miR-135a和miR-135b表达水平比较

2.2不同特征子宫内膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表达水平比较 低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴结转移子宫内膜癌患者的血清miR-135a表达水平明显低于中高分化、Ⅰ～Ⅱ期和无淋巴结转移子宫内膜癌患者，差异有统计学意义(P<0.05)；而低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴结转移的子宫内膜癌患者血清miR-135b表达水平明显高于中高分化、Ⅰ～Ⅱ期和无淋巴结转移的子宫内膜癌患者，差异有统计学意义(P<0.05)。不同年龄、病理类型、肿瘤最大径和肌层浸润情况子宫内膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3不同预后情况子宫内膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表达水平比较 随访2年，出现死亡6例，复发11例和转移9例，为预后不良，其余89例患者为预后良好。预后不良子宫内膜癌患者血清miR-135a表达水平明显低于预后良好子宫内膜癌患者，而预后不良子宫内膜癌患者血清miR-135b表达水平明显高于预后良好子宫内膜癌患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4血清miR-135a和miR-135b表达水平对子宫内膜癌预后不良的预测效能 血清miR-135a和miR-135b表达水平预测子宫内膜癌患者发生预后不良的曲线下面积(AUC)分别为0.830、0.856，二者AUC差异无统计学意义(P>0.05)。根据子宫内膜癌患者是否发生预后不良将两指标进行Logistic回归分析，得到方程Y=—1.87XmiR-135a+1.99XmiR-135b—2.42作为联合检测指标，联合检测预测预后不良的灵敏度为92.3%，特异度为83.1%，AUC为0.932，联合检测预测子宫内膜癌患者发生预后不良的AUC明显大于miR-135a和miR-135b单独检测(Z=2.391、2.247，P<0.05)。见图1和表4。

表2 不同特征子宫内膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表达水平比较

续表2 不同特征子宫内膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表达水平比较

表3 不同预后情况子宫内膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表达水平比较

图1 血清miR-135a和miR-135b表达水平预测子宫内膜癌预后不良的ROC曲线

2.5子宫内膜癌患者血清miR-135a与miR-135b表达水平的相关分析 子宫内膜癌患者血清miR-135a表达水平与miR-135b表达水平呈负相关(r=—0.721，P<0.01)。

表4 血清miR-135a和miR-135b表达水平对子宫内膜癌预后不良的预测效能

3 讨 论

子宫内膜癌以手术切除为主要治疗方式，但手术效果并不理想。因此，寻找对病程和预后具有监测作用的靶标尤其重要。miRNA是一种非编码RNA，具有高度的保守性，对基因具有明显的调控作用，参与了细胞增殖、代谢、分化和凋亡等病理、生理调控过程，并与肿瘤的发生、发展具有密切关系。近年来研究显示，血清中存在多种miRNA，并且性质极为稳定，对酸碱等环境耐受性较好，不易被内源性或者外源性的核苷酸酶降解，并且具有严格的组织特异性和时序特异性[4]。但在病理状态下，miRNA会出现异常表达，并且在肿瘤的诊断和预后评估中越来越受到重视。在子宫内膜癌的研究中，同样发现大量异常表达的miRNA参与了子宫内膜癌的发生、发展，对其诊断和预后的判断具有重要的意义。

miR-135家族包括miR-135a和miR-135b两个成员，在各种癌症中出现异常表达。 miRNA可以作为癌基因或肿瘤抑制因子，多项研究表明miR-135a在癌症进展中起着重要作用，既有促进癌细胞增殖，也有抑制癌细胞增殖的报道[5-6]。miR-135a还可以通过上皮间质转化影响患者的预后。本研究结果显示，子宫内膜癌患者血清miR-135a表达水平明显低于对照者，并且发现子宫内膜癌患者术后血清miR-135a表达水平明显升高，说明miR-135a可能与子宫内膜癌的发病具有一定的联系。本研究结果显示低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴结转移的子宫内膜癌患者血清miR-135a表达水平明显低于中高分化、Ⅰ～Ⅱ期和无淋巴结转移的患者(P<0.05)，说明miR-135a 在预测预后方面也具有潜在的应用价值。进一步研究显示，预后不良子宫内膜癌患者血清miR-135a表达水平明显低于预后良好子宫内膜癌患者(P<0.05)，说明血清miR-135a表达水平降低可能导致了子宫内膜癌患者的不良预后。有关miR-135a表达水平在卵巢癌中表达情况的研究发现，血清miR-135a高表达的卵巢癌患者预后良好，而miR-135a低表达与卵巢癌患者的较低的生存率和无进展生存期缩短有关[7-8]。对非小细胞肺癌的研究发现，血清miR-135a表达水平与远处转移、淋巴结转移、TNM分期、病理分期关系密切，miR-135a低表达的患者生存期明显短于miR-135a高表达的患者，miR-135a表达水平降低是非小细胞肺癌预后不良的独立危险因素[9]。对经典霍奇金淋巴瘤的研究发现，miR-135a低表达的患者复发率更高，无病生存期更短[10]。对肝细胞癌的研究发现，miR-135a的高表达与肝癌切除后12个月内复发的高风险相关[11]。另一项研究发现，胃癌肿瘤组织中miR-135a的高表达与较短的生存期和较短的复发时间有关[12]。本研究结果显示，血清miR-135a表达水平为2.73时，其预测子宫内膜癌预后不良的灵敏度为88.5%，特异度为75.3%，AUC为0.830，说明血清miR-135a表达水平在预测子宫内膜癌患者两年内复发、转移和死亡方面具有较高的价值。

miR-135b位于1号染色体上，定位在1q32.1，在肿瘤的发生、发展中具有重要作用，但在不同肿瘤组织中，其功能不尽相同。如在前列腺癌和胶质母细胞瘤中，miR-135b可作为肿瘤抑制因子[13-14]。然而，在乳腺癌、肝细胞癌和结直肠癌等癌症中，miR-135b是一种肿瘤促进因子，可促进癌细胞增殖和迁移[15-17]。本研究结果显示，入院时，子宫内膜癌组血清miR-135b表达水平明显高于对照组，并且发现子宫内膜癌组术后7 d血清miR-135b表达水平较术前明显降低，说明miR-135b在子宫内膜癌中作为促癌基因存在，与文献[18]报道的结果一致。本研究结果还显示，低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴结转移的子宫内膜癌患者血清miR-135b表达水平明显高于中高分化、Ⅰ～Ⅱ期和无淋巴结转移患者，并且预后不良患者血清miR-135b表达水平明显高于预后良好患者，说明血清miR-135b表达水平与子宫内膜癌的预后关系密切。一项关于脂肪肉瘤的研究发现，miR-135b高表达与预后不良相关[19]。另一项研究表明miR-135b-5p过表达是胰腺导管腺癌预后不良的独立预测因子，具有促进肿瘤细胞增殖和迁移的作用，与肿瘤预后不良有关[20]。本研究结果显示，血清miR-135b表达水平为3.21时，其预测子宫内膜癌患者术后预后不良的灵敏度为73.1%，特异度为84.3%，AUC为0.856，具有较高的预测效能。同时本研究显示血清miR-135a与miR-135b联合检测对子宫内膜癌患者预后不良的AUC明显大于miR-135a和miR-135b单独检测，说明两项指标具有互补性。另外，相关性分析结果显示，子宫内膜癌患者血清miR-135a与miR-135b表达水平呈负相关，进一步说明了二者在子宫内膜癌中具有一定的联系，miR-135a有抑癌作用，而miR-135b有促癌作用，二者处于某种平衡，其具体机制需要进一步研究。

综上所述，miR-135a和miR-135b可能参与了子宫内膜癌的发生及发展过程，是子宫内膜癌预后的潜在预测指标。