高内涵筛选技术在中药现代化研究中的应用

李敏

浙江大学药学院中药科学与工程学系

现代中药创制全国重点实验室，浙江大学长三角智慧绿洲创新中心

沈国芳

杭州市食品药品检验研究院

王毅*

浙江大学药学院中药科学与工程学系

现代中药创制全国重点实验室，浙江大学长三角智慧绿洲创新中心

中医药是中华民族的瑰宝，其在重大疑难疾病、慢性病以及老年性疾病等复杂性疾病的治疗上具有独特的优势，在抗击新冠疫情期间做出了重要的贡献[1]。1996年，我国开始实施中药现代化研究战略。“中药现代化”是指将传统中药的优势特色与现代科学技术相结合，诠释、集成和发扬传统中药的理论和实践，改造和提升中药的现代研究、开发、生产、管理和应用，以适应社会发展需求的过程。在该战略实施的20 多年中，我国在中药现代化研究、中药标准化与质量控制、中药产业化、新药研发以及推动我国中药进入国际医药市场方面取得了重大的进展[2]。

在中药现代化研究中，化学成分是中药/方剂发挥药效的基础。目前针对中药的化学成分研究是中药研究中最活跃的一个方向，取得了快速进展。但是对于很多常用的中药，已清楚和了解的成分仍然很少。中医临床用药大多是方剂。方剂由多种中药组成，成分更为复杂，多种效应物质并存，通过叠加、拮抗或是协同的作用实现治疗效果。因此，如何从复杂的中药物质体系中准确、系统且快速地辨析中药药效物质是中药现代化进程中亟待解决的问题[3]。高内涵筛选技术的出现和发展为快速、系统地筛选中药药效物质提供了强有力的技术支持。高内涵筛选技术能够高通量、多靶点、多通道以及全自动化采集荧光图像并进行分析[4]，符合中药及方剂多靶点的作用特点，非常适用于中药现代化研究中多层次多靶点地评价药效，筛选有效成分，诠释配伍作用以及探究药理机制。

1 高内涵筛选技术的概述

1.1 高内涵筛选的概念

高内涵筛选的概念是美国Cellomics 公司于1997年首次提出，并成功开发出来首个高内涵筛选技术平台[5]。高内涵筛选具体是指在细胞结构和功能完整的前提下，检测药物对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡及信号转导各个环节的影响，从而确定药物的生物活性和潜在毒性[6]。研究者们通常使用荧光探针或荧光蛋白对细胞的结构、细胞因子、功能蛋白以及各种信号分子进行标记[7]，通过自动成像的荧光显微镜高通量地获取细胞的荧光图片，再用分析技术进行多项特征的提取，最终获取反映细胞生理状态的多项数据[8]。

1.2 高内涵筛选平台的组成

高内涵筛选技术主要依赖于自动化的、高分辨率的荧光显微成像技术和荧光标记技术。一个高内涵筛选平台主要由高分辨荧光显微镜、自动化图像采集系统、荧光标记探针/荧光蛋白、图像处理分析软件和数据管理系统以及其他附加模块组成[4]。

第一台高内涵筛选系统在20世纪90年代后期由Cellomics公司生产，主要由全区域发光的白色光源、多道滤光片以及一台图像传感照相机组成，能够进行多色荧光图像采集，并进行定量分析[9]。

1.3 高内涵筛选技术的优势

与传统的高通量筛选相比，高内涵筛选具有较为显著的优势。经典的高通量筛选方法筛选靶点单一，高内涵筛选结果则以多指标、多靶点共同作用作为主要特点[10]，筛选中所涉及的靶点包括细胞的膜受体、细胞器和其他胞内成分等。高内涵筛选和高通量筛选都是使用96/384 微孔板作为载体进行筛选[11]。与高通量筛选相比，高内涵筛选能够获得更多信息，所需要的检测体积与高通量筛选一致，而且操作步骤同样是简单可行且自动化的。更重要的是，高内涵筛选具有单细胞分辨率[9]，换而言之，高内涵筛选获取的信息是以细胞为单位的，而高通量筛选一般是采集一个孔的生化测定平均信号或者总信号，无法获取单个细胞的信号。单个细胞的信号相比于整个孔中细胞的总生化信号或者平均生化信号，能更高程度地模拟实际生理病理情况。这是因为细胞间异质性较高，如果测定的是整个孔中的所有细胞的平均信号，则会掩盖单个细胞的差异。比如，在检测细胞的病毒感染时，采用一个孔的细胞读数，会掩盖siRNA 干扰引起的细胞表型的变化[12]。研究者在高内涵筛选中可以从单个细胞获取信息，从而克服细胞间的异质性这一问题。

2 高内涵筛选技术的发展现状

显微镜技术和荧光标记技术的更新迭代推动了高内涵筛选技术的发生发展（图1），随着更高分辨率、更快成像速度的高内涵成像平台的开发和标记范围越来越广泛的荧光标记技术的出现，高内涵筛选技术在生物医药领域被广泛应用。

图1 高内涵筛选技术的历史沿革

2.1 显微镜技术

图像采集是高内涵筛选的关键步骤，图像的质量决定了整个筛选的质量。在这一步中图像分辨率和放大率最为关键，足够高的分辨率和放大倍数才能满足捕捉表型细节的需求。在图像采集中，必须注意避免成像伪影。照明不均匀或者光源衰减是造成成像伪影的关键原因。随着工程学和计算机科学的进步，越来越多具备稳定光源、高分辨率和快速自动聚焦的自动成像显微镜被开发出来，扩大了视觉表型的自动筛选范围[11]。目前实验室常见的高内涵成像仪器如表1 所示。

表1 常见的高内涵成像仪器

2.2 荧光标记技术

为了观察细胞的表型，大多数高通量筛选使用荧光标记技术对需要观察的细胞结构、蛋白质以及信号分子等进行标记。荧光标记方法主要有基因编码的荧光蛋白、免疫荧光染色和各种化学探针[13]。1987年，Martin Chalfie 和Douglas Prasher 合作克隆了绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）。1994年，Science发布了大肠埃希菌表达GFP 的荧光照片，此后基因编码的荧光蛋白技术使得荧光标记目的蛋白成为可能[14-15]。与荧光蛋白不同，化学染料的使用更为方便，标记范围不仅限于蛋白，还可以标记细胞内的信号分子。本课题组针对氧化应激通路源头分子超氧阴离子[16]、蛋白翻译后修饰关键酶SIRT1[17]、HDAC1[18]、ACE2[19]、DDP4[20-21]等靶点开发了高特异性的新型荧光探针，并将其应用于高内涵筛选中。比如，应用四嗪作为超氧反应基团，连接上不同荧光性质的发色团，开发了一系列高时空特异性超氧探针，使用其中绿色的荧光探针标记了氧化应激损伤后的H9c2 细胞，结合高内涵筛选平台，成功筛选了223 个小分子化合物，从其中发现了4 个超氧抑制剂[16]。得益于研究者们在荧光标记技术方面的努力，越来越多的化学染料[22]、基因编码的荧光蛋白被开发出来，可被荧光标记的亚细胞结构、细胞因子、功能蛋白和信号分子范围越来越广，高内涵筛选的可视化细胞表型大大增加。

2.3 高内涵分析方法

在高内涵筛选中，为了确认命中的化合物，需要对所得图像进行量化，以评估药物诱导的变化。经典的高内涵图像分析流程大致如下：首先，处理图像以减少噪声并校正不均匀照明，这可以使用各种滤波器来完成[23]。其次，将要分析的对象，比如单个细胞或者亚细胞器分割出来。在图像上划定目标分析区域，即定义它们的轮廓，将它们表征为单独的对象，可以使用阈值法，比如Otsu 算法，先得到背景与对象区分开的二值化图像，然后使用分水岭算法分割相邻的对象[24]。最后，从分割得到的对象中计算出许多数字描述符，这些数字描述符是用于编码各种有用的特征来区分细胞表型，比如细胞器的面积或者周长，特定区域的平均强度、测量强度均匀性或异质性、平滑度或者粗糙度等[25]。目前，有许多开源软件集成了多种图像处理方法，比如Fiji[26]或者CellCognition[27]等，使 用方法简单易学，使用简单的宏代码也可以实现批量处理图像，极大地便利了高内涵筛选的图像处理。除了开源软件之外，还有像CellProfiler[28]这样的专用软件，可以自动从细胞绘画图像中提取大约1500 个形态特征。尽管这些软件可以提取出许多细胞特征，但是多数参数是无意义的，这会引入噪声并对下游分析产生不利影响。因此，真正的预测特征需要人为甄别，手动选择。往往高内涵筛选所得到的特征是海量的，需要研究者们使用数据降维方法进行特征提取，比如主成分分析法或者高斯随机投影法等[25,29]。在此之后，对选择或提取的特征进行统计分析。随着计算科学的发展，深度学习、机器学习等方法在图像预处理、分割对象、提取特征和选择特征等方面成为助力高内涵分析的有力工具[30]。本课题组基于深度学习的方法构建了一种自适应的细胞分割算法，利用风格感知的预训练模型，结合对比微调策略，在细胞器、细胞和生物体3 个层次的显微镜图像数据集上实现了最先进的平均精度和聚合Jaccard 指数可转移性。微调该算法，其性能在大约8 张图像后趋于平稳，仅需很少的手动操作即可获得适合用户使用的专业细胞分割模型[31]。此外，药物或者遗传扰动以及随后出现的细胞形态反应之间的关系通常是复杂的，不一定由任何单个特征捕获。因此，与其逐个考虑这些特征，不如通过使用这些特征的适当加权线性组合或者更复杂非线性函数来实现对相关表型的更敏感的区分。如2013年PNAS报道了一项研究[32]，研究者将细菌接种在384 孔板上，用大约20 种不同的抗生素处理，并对DNA 和膜进行染色。从图像中提取100 多个特征，在这些特征上训练随机森林算法，并再次发现能够基于6 种参考抗生素区分的具有不同作用机制的抗生素。除了研究药物的机制，筛选对某种疾病具有治疗效果的药物也是高内涵筛选的主要应用方向，如何对产生的荧光图像数据集进行高效的分类和解析也一直是研究者们的兴趣所在。比如，DNA 损伤是许多复杂疾病的罪魁祸首之一，人们对发现调节DNA 损伤的新型先导化合物充满了兴趣。然而，通过计算核内病灶的数量来评估DNA 损伤仍然存在很多挑战。本课题组开发了一个基于深度学习的开源算法FociNet，用于自动分割全场荧光图像并分析每个细胞的DNA 损 伤。FociNet 能 够对各种成像平台拍摄所得的荧光图像进行分析，高效分类损伤细胞和正常细胞。该算法被成功地应用于分析315 种中药天然化合物的高内涵筛选所得的5000 多个病灶图像数据集。首次鉴定发现吴茱萸碱、异甘草素和草质素可以减少辐照诱导的foci[33]。

2.4 用于高内涵筛选的模型

目前，大多数的高内涵筛选使用二维（2D）培养的细胞。2D 细胞一直是了解疾病和药物功能机制的有力工具。在细胞培养过程中，细胞生长为附着在培养瓶/培养皿表面的单层[34]。这种培养方法有许多缺点。比如，细胞和细胞外环境缺乏相互作用，结构与在体组织相比显示出改变的形态，以及上皮细胞极性的丧失。此外，2D 培养的细胞可以无限制地获得培养基成分，如营养物质、代谢物和信号分子，这与生理条件不相似，可能导致非自然的基因反应和细胞生物化学反应[35]，从而无法模拟组织中存在的细胞功能和信号通路。因此，与在体组织相比，2D 培养的细胞也可能无法模拟在体组织对药物的反应[36]。近年来，许多研究者致力于开发与在体组织生理相关程度更高的模型，从而提高筛选结果转化临床应用的可行性。比如，与2D 培养的细胞不同，三维（3D）细胞培养提供了细胞可以在3 个维度上相互作用的环境，可以进一步模拟在体组织[37]。类器官是3D 细胞培养的一种。早在2009年，Hans Clevers 实验室就首次将单个肠道干细胞接种在基质胶中，使其增殖并获得了复杂的3D 组织结构，这些复杂的3D 细胞结构包括干细胞和各种分化的细胞构型被称为是第一个“现代”类器官[38]。目前，已有成熟的实验方案可以获取类器官，主要有两种途径：一种途径是用胚胎干细胞或者多能干细胞的固有自组织能力形成类似体内组织的3D 结构；另一种途径则是使用器官特异性成体干细胞[37]，它们能自我更新并产生祖细胞，祖细胞增殖并分化成为存在于其来源组织中的所有细胞类型[39]。鉴于类器官复杂性及其成熟的培养技术，人们期望类器官可以减少或者取代药物筛选中的动物模型。Vlachogiannis 等[40]培养了一种转移性胃肠道癌症患者的衍生类器官模型，用它们来预测患者的治疗反应，并使用了一个化合物库测试了类器官对患者反应的敏感性。研究结果表明，阳性预测值为88%。由此说明，类器官可以用于高通量药物筛选，并且能够更高程度地模拟在体组织的情况。利用3D细胞培养技术，构建更贴近在体组织的仿生模型，有望加速高内涵筛选实验结果到临床应用的转化。除了使用3D培养的细胞或者类器官，本课题组还利用斑马鱼和线虫这样的模式生物构建了模拟多种疾病的高内涵筛选模型。图2 对本课题组已有的高内涵筛选模型及药效评价模型进行了总结。比如，首先使用阿霉素构建斑马鱼心衰模型，结合深度学习实现了使用斑马鱼胚胎高内涵筛选了300 余个中药化合物，并首次发现了氯化矢车菊素、迷迭香酸、2''-O-酰基金丝桃苷等10 余个具有抗心衰活性的中药成分，并对氯化矢车菊素的药效在整体动物模型上进行了评价，深入研究了其抗心衰的作用机制[41]。此外，本课题组还在过表达皮胶原XII（COL-12）的秀丽隐杆线虫上使用GFP 标记了COL-12，之后利用高内涵筛选系统和图像分割算法Scellseg 构建了基于线虫的高内涵筛选模型。探索可能在胶原生物发生、分泌和组装中发挥重要作用的天然小分子化合物，对614个天然小分子化合物进行了筛选，经过验证筛选所得的丹参素、指甲花醌和血根碱对COL-12 的合成或分泌更有效[42]。

图2 多尺度药效评价模型

3 高内涵筛选技术在中药现代化研究中的应用进展

近年来，在中药领域使用高内涵筛选技术的研究逐年攀升。在中药现代化研究中的高内涵筛选可以大致分为两种：基于靶点的筛选和表型筛选。对于基于靶点的筛选，首先要明确靶点，再用荧光标记的方法，比如基因编码的荧光蛋白或者是化学染料，使感兴趣的靶点可视化。而表型筛选则是基于细胞整体的表型变化来筛选药物，不需要靶点先验知识，可检测的表型包括细胞或细胞器形态、细胞代谢情况、细胞黏附迁移情况、细胞周期调节和凋亡情况以及第二信使等。明确了使用哪种筛选之后，研究者一般会先构建相关的细胞模型，使用荧光标记技术对靶点和表型进行可视化，这里需要研究者在大规模筛选应用之前，首先测试模型是否构建成功以及荧光标记是否成功，以确认适用性并确保特定和可测的关键靶标或表型。在此之后，再进行大规模筛选，用于筛选的对象可以是方剂、药材提取物、组分以及中药单体化合物，将药物与细胞共孵育后，进行荧光标记（由基因编码的荧光蛋白则略过这一步），使用高内涵成像平台获取高通量的细胞图像，对图片进行分析处理或特征提取，数据分析后，获得有效的化合物，最后对所获得的化合物进行二次筛选或者使用其他手段验证其药效。目前，研究者们大多利用2D 培养的细胞进行高内涵筛选以研究中药药效物质、评价药物安全性和中药质量以及提升中药标准化和产业化。

3.1 应用高内涵筛选技术研究中药药效物质

高内涵筛选技术在中药药效评价和中药药效物质发现的研究中广受研究者的青睐。研究者们常使用表型筛选的方式，构建对应疾病的体外模型，对其中的关键表型进行荧光标记，再使用高内涵筛选技术评价药效以及筛选有效成分。

方剂是中医临床遣方用药的主要形式[3]，体系复杂、化学成分繁多，因此高内涵筛选在中药复方研究中优点最为突出。本课题组将高内涵筛选技术与高分辨质谱、液质联用技术结合起来，构建了斑马鱼炎性肠病高内涵筛选模型，从桃花汤、白头翁汤、葛根芩连汤3 个与炎性肠病相关的仲景方中制备了74 个组分，以活性氧水平为筛选标准，发现了6 种有效成分对肠道的炎症表型具有较强的抑制作用[43]。在血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大模型上明确了通脉养心丸对心肌肥大的抑制作用，并从该复方中鉴定出了4 种抗心肌肥大的有效成分[44]。同样是对通脉养心丸的研究，Liu等[45]构建了肾小管上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）体外模型，使用高内涵筛选技术自动采集和处理双荧光标记的图像识别EMT抑制剂，结合色谱分离和质谱联用技术，发现了其中5 个组分具有抗EMT 活性，从中进一步鉴定了甘草酸、粗毛甘草素A 和甘草酸内酯A 对EMT 有抑制作用。此外，一些方剂在临床应用中具有显著的疗效，但是药效物质基础不明确，使其广泛应用被限制，高内涵筛选技术在鉴定这类方剂的药效物质基础方面优势突出。比如，宣肺败毒方在临床治疗新冠病毒感染中疗效显著，但药效物质基础和作用机制不明确，本课题组在高分辨质谱、液质联用对复方成分分离鉴定的基础上，结合质谱分子网络技术和高内涵筛选，在巨噬细胞系和斑马鱼损伤模型中鉴定了宣肺败毒方中来自不同药材的多种活性成分的生物学效应，比如虎杖、芦根和化橘红中的虎杖苷、异甘草素和洋丁香酚苷可以强烈下调巨噬细胞的活化。茅苍术、青蒿草和麻黄中的活性成分白术内酯I、山柰酚和麻黄碱被发现能显著抑制内源性巨噬细胞的迁移[46]。

高内涵筛选技术在单味中药和中药化合物的药效物质中应用也颇为广泛。赵志敏等[47]利用高内涵筛选技术观察黄芪来源的成分对肝窦内皮细胞缺氧损伤的保护作用，实验结果表明，黄芪来源的7 种单体成分对缺氧损伤的肝窦内皮细胞有明显保护作用。在中药化合物药效研究中，Wang 等[48]使用转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导正常大鼠的肾成纤维细胞NRK-49F纤维化，建立了稳定的肾纤维化体外模型，以肌成纤维细胞标志α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）作为检测指标，筛选了包含344个中药分子的标准中药化合物库，共鉴定出16 种化合物具有潜在的抑制活性。Wang 等[49]利用高内涵筛选技术成功在中药化合物库中筛选出丹酚酸A、丹酚酸B 和鞣花酸对泛素-蛋白酶体系统有激活作用。上述研究均基于固定的时间点对细胞进行图像采集分析，而高内涵成像不仅可以对固定时间点的细胞进行采集，还可以对细胞效应进行动态追踪。倪晓晨等[50]使用高内涵成像追踪细胞轨迹并对细胞运动功能进行测定，在伤口愈合模型上鉴定了南蛇藤提取物能够剂量依赖性地抑制非小细胞肺癌细胞的迁徙能力。

目前，使用高内涵筛选技术研究方剂、中药以及中药化合物的有很多，但是对于组分配伍和优化的研究较少。组分配伍是中医遣方用药的核心，对组分配伍的研究可能是阐释其中科学内涵的一种解题思路[3]。毕蕾等[51]利用高内涵筛选平台分析丹参-人参组分配伍对肺癌A549 细胞迁移的作用，结果表明，丹参-人参组分配伍可以显著降低细胞迁移的面积，对A549 细胞迁移有抑制作用，且呈剂量依赖性。充分表明了中药组分配伍可以起到增效的作用，而高内涵筛选技术的高通量、多通道特点，为研究中药组分配伍研究提供了强有力的平台。本课题组在国内率先使用高内涵筛选进行中药药效物质的研究，并在组分配伍研究方面做了一些探索。综合运用前文提到的针对氧化应激通路源头分子超氧阴离子、蛋白翻译后修饰关键 酶SIRT1、HDAC1、ACE2、DDP4 等靶点开发的高特异性的新型荧光探针，采用“亚细胞器—细胞—3D 细胞球/类器官—整体动物模型”多层次高内涵药效评价方法和基于深度学习的高内涵图像分析方法[32-33]，构建了具有多靶点标记技术、多层次药理学模型以及人工智能（AI）赋能高效分析方法的高内涵筛选平台用于中药药效物质研究，并结合中医药典籍等文献资料，整合方剂化学分析数据和多组学数据等，运用知识发现和关联分析等手段，挖掘出方-证-病间相互关系，研究发现了ACE2、SGK1、SIRT1 等中成药治疗心血管疾病的潜在作用靶点群，明确了主要作用途径以合理选择评价模型，从而发现了一批中药药效物质，对通脉养心方[34]、宣肺败毒方[36]和冠心宁片[52]的药效辨析、组分配伍和作用机制的研究充分证明了高内涵筛选技术在明晰中药复方配伍规律、作用机制和有效成分群辨识方面的潜力，研究流程概括总结如图3 所示。

图3 本课题组应用高内涵筛选技术研究中药流程示例

3.2 应用高内涵筛选技术评价中药安全性

中药临床应用的安全性缺乏科学、客观的评价方法和标准规范，一直是中医药研究者和百姓关注的问题，建立中药安全性预警体系是中药现代化发展中需要直面的问题。高内涵筛选技术与传统分析技术相比，能够通过较少的实验全面地获得因药物造成的细胞形态和标志分子的微小变化，更加准确地分析出药物的潜在安全隐患[53]。

郭晓等[54]使用HEK293 细胞系作为模型，选择具有明显肾损伤的化合物马兜铃酸A 和环孢素A 作为阳性对照，建立了一种基于细胞表型的高内涵多指标中药肾损伤检测方法，检测指标为细胞存活率、细胞核面积、细胞核圆度、线粒体质量和线粒体膜电位。对文献中报道的18 种具有潜在肾损伤的中药化合物进行筛选。实验结果表明，该方法可应用于建立中药肾损伤安全预警体系。方剂中具有潜在肾损伤成分的发现也非常重要。杨春启等[55]通过高内涵成像系统结合肾小管上皮细胞HK-2 模型筛选了左金丸中主要生物碱类组分对肾细胞的损伤，通过高内涵成像系统对细胞数目、细胞膜通透性和线粒体膜电位的分析，发现了该复方中吴茱萸碱能够显著降低细胞数目导致细胞损伤，是导致肾损伤的主要成分，为安全使用该方剂提供了客观科学的指导。此外，高内涵分析技术还可以应用于肾损伤机制的研究中。路青瑜等[56]使用高内涵筛选技术分析了山柰酚对细胞数目、活性氧水平、线粒体膜电位和Ca2+内流水平的影响，鉴定了山柰酚对人肾近曲小管HK-2 的毒性之后，使用免疫荧光的方法对氧化应激相关蛋白标记后，在高内涵筛选系统上进行分析，进一步发现其损伤机制与促进活性氧水平升高而导致氧化应激损伤和细胞凋亡相关。

此外，药物潜在的肝损伤在药物开发和临床应用方面一直备受关注，因为肝脏承担着药物代谢转化的关键作用。目前已明确具有潜在肝损伤风险的中药包括生物碱类（如千里光属、泽兰属、款冬属等）、苷类（如黄药子、何首乌等）、毒蛋白类（如蓖麻子、相思豆等）、多肽类（如毒蕈伞含有的毒伞肽和毒肽等）、萜与内酯类（如川楝子、艾叶等）、鞣质类（如五倍子、石榴皮等）、动物类（如蜈蚣、蟾酥等）、矿物类（如含汞、砷、铅的矿物药等）[57]。但是还有许多中药在服用过程中造成肝损伤的发病机制和原因尚不明确，需要研究者们深入研究。高内涵筛选技术因其能够灵敏稳定、简单易行地获得目的药物对细胞产生的实时多维立体的生物效应信息，为体外预警肝损伤风险和研究其作用机制规避损伤风险提供了强有力的工具。耿兴超等[58]为了筛选何首乌中潜在的致肝损伤的风险成分，采用4 种人源肝细胞系建立CCK-8 体外高通量筛选方法，对其总提物及其分部进行筛选，确定潜在风险成分分部。对其中16 种代表性单体化合物进一步筛选，确定潜在风险成分。最后通过高内涵分析平台检测潜在风险成分对亚细胞器的影响，初步探索其机制，基本确定了没食子酸为何首乌中潜在的致肝损伤的危险成分，确定了其通过引起内质网应激导致肝细胞损伤。除了这种针对某种中药或者方剂的潜在肝损伤成分的发现和机制研究，余璇等[59]基于两种肝细胞系，采用多种荧光探针分析多种细胞表型，对56 种中药活性成分进行了肝损伤快速筛选评价，筛选结果证明了高内涵筛选方法适用于大规模初步筛选预警中药活性成分潜在的肝损伤风险。

多种研究实例证明，高内涵筛选技术因其能够快速获得多维细胞生物学效应，从而能快速简便地评价和筛选从中药化合物到复杂方剂潜在的风险成分，并发现关键致机体损伤成分，但是目前研究多集中于中药潜在的肝肾损伤研究中，对其他潜在的风险研究较少，且多集中于中药活性化合物的应用，缺乏对方剂和组分的评价。

3.3 应用高内涵筛选技术建立中药质量评价体系

中药质量评价是中药现代化进程的关键问题之一，中药材、中药饮片以及中药复方制剂的质量是保证中药临床有效性、安全性的基础，同时也是促进中药国际化、产业化和现代的关键[2]。中药的质量是中药化学物质综合生物效应的整体表现，其特点是多成分、多功效和整体性。现代中药质量评价体系以“找成分，测含量”为主，以高效液相色谱、液质联用、紫外光谱等技术为主的化学评价能够宏观地反映中药的物质成分，而基于生物体系和药效实验的生物评价则更能够总体评价和表征中药的安全性和有效性[60]。高内涵筛选技术与传统的分析实验相比，高内涵成像平台多通道地采集药物对细胞的生物学效应，发现中药的生物质量标志物，从而构建分析方法，方法构建完毕后，能够通过较少的样本和较少的实验以及较少的时间高通量地快速评价多批次、多产地的中药质量。比如，阿胶作为临床常用的名贵中药，长期以来因产品质量问题备受关注，究其原因是与其临床功效相关的质量评价方法的缺失。刘靖等[61]采用高内涵筛选技术，建立了基于小鼠巨噬细胞系RAW 264.7 吞噬模型的阿胶生物活性评价方法，实现了对不同品质的阿胶的质量评价。在相同的细胞模型上，曹俊岭等[62]结合高内涵分析，比较了铁棍山药和非铁棍山药促进巨噬细胞吞噬活性的差异，分析了11 个批次山药的药效，铁棍山药的生物效价明显高于非铁棍山药，为山药的质量评价构建了快速简便的方法。

3.4 应用高内涵筛选技术助力中药标准化和中药新药药品注册

中药标准化是中药现代化的重要内容之一[2]，包括中药质量标准的现代化和国际化、中药质控技术的现代化、中药安全性评价研究。如前文提到的，已有研究将高内涵筛选技术应用于评价中药的毒性，构建中药毒性预警体系[45-49]。另外利用中药的生物学效应，应用高内涵分析技术构建快速简便的质量评价体系[51-52]。证明了高内涵筛选技术在中药标准化方面有着巨大的应用前景。高内涵筛选技术所获得的中药材、中药复方以及中药制剂的多维、海量的生物学效应信息对进一步提高中药质量标准的现代化和国际化大有裨益，同时也可以作为现代化中药质控技术的一种。此外，该技术还能实现快速评价中药安全性，全面助力提升中药标准。

中药新药研发的主要来源是中医药长期的临床实践与经验总结，现有的中药复方新药研究多是基于已有临床实践经验和确切疗效的中药方剂基础上的研究，来源主要包括经典名方、临床经验方、民间药方等[63]。2015～2020年，中药新药获批的数量为个位数，尤其从2016年开始，每年仅有1～4 个品种获批[64]。2019年发布的《中共中央 国务院关于促进中医药传承创新发展的意见》中提出：改革完善中药注册管理，及时完善中药注册分类，加快构建中医药理论、人用经验和临床试验相结合的中药注册审评证据体系。支持中药新药以临床应用价值为导向，注重药品的安全性、有效性和质量可控性[64]。因此，对于中药新药研发要加强物质基础、药效特点、安全性研究和评价、借鉴现代医学的循证医学理念创新中药临床疗效评价体系、充分采用适宜的制剂技术，确保发挥疗效优势和降低安全风险[2]。高内涵筛选技术在明晰中药作用机制、辨识有效成分群、定量设计和优化有效成分群组方和质控方面具有明显的优势。比如，在作用机制和有效成分辨识方面，本课题组在红景天、通脉养心方[34]、宣肺败毒方[36]和冠心宁片[52]的药效辨析和作用机制的研究，充分证明了高内涵筛选技术在明晰中药或中药复方作用机制和有效成分群辨识方面的潜力。中药复方需要从多组分、多剂量、多配比中优选[2]，而高内涵筛选技术能够同时获取高通量、多维度信息的特点则恰好符合实现自动化优化多变量、多指标的需求。因此，高内涵筛选技术能够为中药新药注册和获批提供更多的研究信息和科学支撑，助力中药新药注册。

4 展望

面对中药现代化的发展需求，高内涵筛选技术为中药药效物质研究、中药安全性评价以及中药质量评价提供了有力的帮助。如上所述，广大中药研究者也借助高内涵成像平台解决了中药现代化中的一些问题，研究者能够利用高内涵成像多通道、多靶点的特点较为全面地发现中药药效物质及作用靶点，系统地揭示其中一些方剂的科学内涵，但尚有许多问题未能解决，比如目前中药研究中高内涵筛选的通量较低，对于组分配伍和组分优化的研究甚少。随着荧光标记技术的进步，越来越多的靶点、信号分子和蛋白质能够可视化，3D 仿生模型构建技术、微流控技术的发展则使可用于高内涵筛选的体外模型越来越贴近真实的在体组织、光学显微镜的迭代更新会使高内涵成像系统的分辨率越来越高，能够捕捉更微小的生物学效应，图像分割、特征提取以及机器学习的算法的推陈出新也使得高内涵分析能力越来越强。未来可能借助更加强大的高内涵筛选云平台，实现自动化（无人值守复合机器人系统避免实验误差）、数字化（全生命周期管理实现实验流程追溯和实验数据分析平台支撑多维度筛选）和智能化（智能化引擎精准调度实验操作和智能化设备支持多种研发实验流程）的中药现代化研究，比如中药功效组分智能辨识与组方优化等。