人乳头瘤病毒疫苗的概况及重组三价人乳头瘤病毒疫苗的研发

刘玉莹

北京康乐卫士生物技术股份有限公司

陈晓

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伍树明

北京康乐卫士生物技术股份有限公司

银飞

北京康乐卫士生物技术股份有限公司

刘永江*

北京康乐卫士生物技术股份有限公司

人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是女性生殖道及皮肤黏膜常见病原体，其感染比较常见，80%以上女性一生中至少感染过1 次HPV[1]。一项由世界卫生组织国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）主导的研究表明，世界范围内22 个国家的1000 例组织学确认的浸润性宫颈癌病例的HPV检测结果显示，99.7%的宫颈癌呈现HPV-DNA 阳性，表明HPV是诱发宫颈癌的主要因素[2-4]。HPV 感染宿主上皮细胞后，会使宿主基因组发生不稳定和不可逆的改变。研究证明，高危型HPV的E6 和E7 分别通过降解抑癌基因p53和pRb来诱发宫颈癌[5-6]。病原生物学、流行病学等证据充分表明，宫颈癌是由高危型HPV的持续感染引起的[7]。目前已经确认，HPV 可以引起宫颈癌、阴茎癌、外阴癌、阴道癌、肛门癌和口咽癌（食管癌）等恶性肿瘤[8-16]。

1 HPV 分型

根据国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）的报告，HPV 属于乳头瘤病毒科（Papillomaviridae）。乳头瘤病毒科已知有至少53 个属，HPV主要分布在Alphapapillomavirus（共14 个种，其中13 个种含HPV）、Betapapillomavirus（共6个种，其中5个种含HPV）、Gammapapillomavirus（共27 个种，均含HPV）、Mupapillomavirus（共3 个种，均含HPV）和Nupapillomavirus（共1 个种，含HPV）这5 个属中[7]。目前已知的HPV 有200 多个型别，分属上述5 个属中的40 多个种。不同型别HPV 的L1基因序列差异大于10%，而同一型别HPV 的序列差异小于2%[17]。国际癌症研究机构专题工作组依据HPV致癌性的不同将其分为三类，即高危型、低危型和可疑高危型[18-19]。我国HPV 检测的型别范围依据2015年11月26日原国家食品药品监督管理总局发布的《人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型、试剂技术审查指导原则》明确为：①高危型HPV：包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68，共13 种基因型，具有确定的致癌性。高危型HPV 主要属于HPV 系谱分类的α属内的不同种（包括Alphapapillomavirus5、Alphapapillomavirus6、Alphapapillomavirus7、Alphapapillomavirus9），其中HPV16和HPV58属于Alphapapillomavirus9，HPV18属于Alphapapillomavirus7。高危型HPV 的感染与宫颈癌及癌前病变的发生密切相关，此外还与肛门癌、阴道癌、口咽癌及癌前病变的发生密切相关。②低危型HPV：包括HPV6和HPV11，属于HPVα属的Alphapapillomavirus10，无致癌性。HPV6 和HPV11 的感染与90%以上的尖锐湿疣和低级别鳞状上皮增生病变的发生密切相关。③可疑高危型HPV：HPV26、53、66、73 和82，共5 种基因型。

2 HPV 的分子流行病学

宫颈癌是由高危型HPV 的持续感染引起的。不同的HPV型别在世界各地的流行病学分布不同。根据人乳头瘤病毒资讯中心（HPV Information Centre）发布的最新调查报告，在全球范围内，宫颈癌患者中宫颈细胞学检测结果显示，前10 位的HPV感染型别为：HPV16（55.2%）、HPV18（14.2%）、HPV45（5.0%）、HPV33（4.2%）、HPV58（3.9%）、HPV31（3.5%）、HPV52（3.5%）、HPV35（1.7%）、HPV39（1.5%）、HPV59（1.4%）[20]。在中国，宫颈癌患者中宫颈细胞学检测结果显示，前10 位的HPV感染型别为：HPV16（59.5%）、HPV18（9.6%）、HPV58（8.2%）、HPV52（6.5%）、HPV33（3.5%）、HPV31（2.8%）、HPV59（2.6%）、HPV45（1.9%）、HPV39（1.5%）、HPV56（1.1%）[20]。

2023年，人乳头瘤病毒资讯中心最新的数据统计显示，在全球范围内宫颈细胞学检查正常的女性中，HPV 感染率为29.8%。按洲统计，大洋洲最高，为66.7%；其次是非洲、美洲和欧洲，分别为39.2%、34.5%和27.2%，最低的是亚洲，为20.8%[20]。此外，有报告指出HPV 感染主要通过性行为传播，其感染率高低主要取决于人群的年龄和性行为习惯。年轻的性活跃女性子宫颈部位HPV 感染率最高，感染高峰年龄在20 岁左右。我国女性存在第二个HPV 感染高峰，在40～45 岁[21]。在中国，宫颈细胞学检查正常的女性中，最常见的5 个型别是HPV52（2.8%）、HPV16（2.7%）、HPV58（1.7%）、HPV33（1.1%）和HPV18（1.1%）[20]。

3 HPV 疫苗国内上市情况

接种HPV 疫苗是阻断HPV传播的最经济、有效的手段[22-23]。早期动物乳头瘤病毒模型（棉尾兔乳头瘤病毒）研究表明，以感染性病毒颗粒或者去除病毒DNA成分的病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）免疫动物后，可以预防乳头瘤病毒的感染，为研制HPV 疫苗的可行性提供了证据[24-26]。在20 世纪90年代初期，制备了HPV 的VLP，证明了重组HPV 疫苗的技术可行性[27]。同时期，众多研究队伍致力于HPV 疫苗的研制，其基本技术路线的原理均为通过DNA 重组技术体外表达HPV 主要衣壳蛋白L1，利用其自组装形成VLP 的特性用作免疫原[28]。HPV L1 形成的VLP可以使机体产生中和抗体，从而阻止病毒感染，实现对宫颈癌等HPV 相关疾病的有效预防。目前认为，所有HPV 疫苗诱导的保护性中和抗体均为L1 蛋白的构象特异性抗体[29]。

2006年，美国食品药品监督管理局(FDA)正式批准默沙东公司生产的Gardasil HPV 预防性疫苗上市。它是由酿酒酵母表达并纯化的HPV6/11/16/18 L1 VLP 四价宫颈癌预防性疫苗。该疫苗被批准用于预防9～45 岁女性HPV6、11、16、18感染所引起的宫颈癌、阴道癌、外阴癌和肛门癌及癌前病变和生殖器疣[30]。这是FDA 批准的世界上第一个肿瘤疫苗。随后，英国葛兰素史克公司生产的商品名为Cervarix 的HPV 预防性疫苗也成功上市。它是来源于昆虫杆状病毒表达系统的HPV16/18 L1 VLP 二价宫颈癌预防性疫苗，使用AS04 佐剂（氢氧化铝复合单磷酸脂质A），每0.5ml 的二价疫苗中HPV16/18 的L1 蛋白含量为20μg。这些成分吸附于含500μg 氢氧化铝和50μg 3-O-去酰基-4'-单磷酰脂质A 的AS04 佐剂系统中。该疫苗被批准用于9～45 岁女性，预防HPV16、18 病毒感染引起的宫颈癌、宫颈原位腺癌及癌前病变[31]。2014年，美国FDA 批准默沙东公司生产的重组九价HPV 疫苗Gardasil9（HPV6/11/16/18/31、33/45/52/58 九价疫苗）上市，从而成为全球第三种已上市HPV 疫苗。在我国，厦门大学联合厦门万泰沧海生物技术有限公司研发生产的二价HPV 疫苗馨可宁（Cecolin）在2019年被批准上市。2022年，玉溪泽润生物技术有限公司生产的二价HPV 疫苗沃泽惠也成功上市。3 款进口疫苗价格昂贵且供应有限，满足不了全球疫苗接种的需求。馨可宁每剂售价约为 Cervarix 的一半，疗效却与 Cervarix 相似。馨可宁和沃泽惠对于9～14 岁女性可采用2 剂次接种。这2 款国产疫苗的上市，很好地解决了进口疫苗价格昂贵且供应有限的问题，但这仍无法满足全球日益增长的疫苗接种需求。表1展示了我国已上市的5 款疫苗概况。

表1 我国已上市的5 款疫苗概况

4 重组三价HPV疫苗的研发及其创新性

目前全球HPV 疫苗接种率仍不理想，远远低于世界卫生组织2030年“健康人群”的目标。因此需要加快疫苗的研发步伐，以满足全球疫苗接种的需求。本公司积极响应世界卫生大会通过的《加速消除作为公共卫生问题的宫颈癌全球战略》及提出的“90%的女童在15 岁前全程接种HPV 疫苗”目标，致力于重组HPV 疫苗的研发。根据HPV 流行病学数据，中国前3 位的HPV致癌型别为：HPV16（59.5%）、H P V 1 8（9.6%）、H P V 5 8（8.2%）[20]。本公司选择大肠埃希菌原核表达系统，以16、18、58 型HPV 病毒作为靶向病毒株，开发了重组三价人乳头瘤病毒（16/18/58 型）疫苗（大肠杆菌）（以下简称重组三价HPV 疫苗），用于预防HPV16、18、58 感染和由此导致的宫颈癌等相关疾病，预防范围达77.3%，比已上市二价HPV 疫苗预防范围增加了8.2%。本产品和已上市的疫苗技术路线基本相同，由单个HPV的主要衣壳蛋白L1，自动装配成VLP，其结构和天然HPV 颗粒几乎没有差别，具有良好的免疫效果。用基因工程表达的L1 蛋白直接装配出来的VLP 大小、形态各异，稳定性较差，还需要对其进行纯化：先解聚得到五聚体，再重新组装成VLP。

HPV VLP 疫苗工艺一般包括菌种库建立、菌种发酵、菌体收获、裂解、澄清纯化、层析纯化、VLP 组装、换液、除菌过滤等步骤。目前，VLP 疫苗纯化存在的问题主要有两个方面：一方面是可溶蛋白少（产量低）、易形成无规则的聚集体；另一方面是宿主内毒素和DNA 残留高。因此，我们对L1基因序列进行了优化：①从结构入手，提高表达量，降低无规则聚集和蛋白降解。②从工艺优化入手，以结构为基础防止宿主内毒素和DNA 被VLP 包裹。研究发现：HPV L1 N 端参与五聚体间相互作用，但N 端截短不超过9 个（含9 个）氨基酸时，不影响HPV L1 五聚体形成VLP（T=7）；C 端不超过30 个氨基酸的截短亦不影响形成由72个五聚体组成的VLP（T=7）[32-33]。由于全长HPV L1 蛋白不能或很难在大肠埃希菌中表达，采用N端截短的方式，可以提高大肠埃希菌表达系统表达HPV L1 可溶性蛋白的表达量。采用C 端截短的方式，可以减少L1 蛋白降解，形成更多的、折叠正确的L1 五聚体蛋白，减少多聚体的形成，使得L1 蛋白在表达和纯化过程中主要以可溶性五聚体形式存在，进一步降低了纯化难度，有利于提高纯化收率和产量，均一的L1 五聚体也保证了组装后VLP 的均一度，从而获得高纯度、均一性好的VLP，显著改善了产品质量，有效解决了VLP 纯化过程中纯度和收率低的问题，实现了VLP 的高效率组装，为HPV VLP 的研究提供了新的研发思路。

5 重组三价HPV 疫苗免疫原性研究

HPV 疫苗能够诱导特异性中和抗体，保护机体免受病毒侵害。因此，疫苗成功的关键是诱导有效的体液免疫，产生具有保护作用的中和抗体，对中和抗体的水平和持久性的研究是评估疫苗保护效果的重要依据[34]。

5.1 重组三价HPV疫苗在小鼠体内的免疫原性研究

针对本公司自制的重组三价HPV 疫苗开展免疫原性研究，以默沙东公司生产的Gardasil疫苗为阳性对照，分别免疫小鼠，检测血清中的中和抗体滴度水平，检测结果如图1 所示。

图1 重组三价HPV 疫苗和阳性对照疫苗在小鼠体内的中和抗体滴度水平变化曲线

图1 中,黑色实线为重组三价HPV 疫苗免疫后的中和抗体滴度的动态变化，红色实线为相同剂量阳性对照疫苗Gardasil免疫后的中和抗体滴度水平变化曲线。图1 中，中和抗体滴度以Log10表示，误差棒表示95%置信区间。

从图1 可以看出，HPV16 VLP 产生的中和抗体滴度水平与阳性对照疫苗基本一致；HPV18 VLP 产生的中和抗体滴度水平略高于阳性对照疫苗；HPV58 VLP 产生的中和抗体在较高滴度水平。

5.2 重组三价HPV 疫苗在大鼠体内的免疫原性研究

针对本公司自制的重组三价HPV 疫苗开展免疫原性研究，以默沙东公司生产的Gardasil 疫苗为阳性对照，测定了重组三价HPV 疫苗在大鼠中的免疫原性，并观察了其免疫持久性（21 周），检测结果如图2 所示。

图2 Wistar 大鼠免疫后HPV 特异性体液免疫应答

图2 中，黑色实线表示重组三价HPV 疫苗免疫大鼠后测定的结合/中和抗体滴度平均值；红色实线表示为阳性对照疫苗Gardasil 免疫大鼠后测定的结合/中和抗体滴度平均值。图2 中，结合/中和抗体滴度以Log10表示，误差棒表示95%置信区间。

从图2A、图2C 可以看出，HPV16、18 VLP产生的结合抗体滴度水平与阳性对照疫苗基本一致；从图2E 可以看出，HPV58 VLP 产生的结合抗体滴度水平较高。从图2B、图2D、图2F 可以看出，HPV16 VLP 产生的中和抗体滴度水平与阳性对照疫苗基本一致，HPV18 VLP 产生的中和抗体滴度水平略高于阳性对照疫苗，同时HPV58 VLP 产生了较高的中和抗体滴度。

图1 和图2 的结果表明，重组三价HPV 疫苗可使小鼠和大鼠产生高滴度、持久性强的特异性中和抗体，且免疫效果与已上市疫苗相当。未来，该疫苗有望成为进口疫苗的有力竞争对手。

6 总结与展望

HPV 感染引起的疾病一直是人类关注的焦点。世界卫生组织于2020年11月17日 发布《加速消除宫颈癌全球战略》（Launch of the Global Strategy to Accelerate the Elimination of Cervical Cancer），全球194 个国家承诺共同消除宫颈癌，以期到2030年，HPV 疫苗接种覆盖率达90%、筛查覆盖率达70%以及宫颈癌前病变和宫颈癌治疗可及性达90%。HPV 疫苗在预防宫颈癌方面发挥着非常重要的作用。在过去20年中，HPV 疫苗研究快速发展，二价、四价和九价疫苗均已获得上市许可，有效预防了全球HPV 感染。康乐卫士采用原核表达系统研发了多款HPV 疫苗，包括重组三价HPV疫苗，重组九价HPV 疫苗，以及覆盖全部高危型别的重组十五价HPV 疫苗。这些HPV 疫苗通过基因工程设计、生产工艺优化等方式提高了产量，从而大大降低生产成本，未来将在预防HPV感染方面发挥重要作用。相信在全体科研人员的努力下，人类将不再受HPV 感染的困扰。