miR-212-5p调控NF-κB影响CSE诱导的MRC-5细胞炎症因子释放和凋亡

陆辉志 付守芝 谭赟 曹松 董辉 杨璐瑜

(武汉市第三医院重症医学科，湖北 武汉 430071)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种常见的可预防、可治疗的疾病，有害颗粒或者气体造成的肺组织及呼吸道中慢性炎症是其发生的重要原因〔1〕。与COPD发生有关的靶细胞有多个，其中肺成纤维细胞和气道重塑关系密切〔2〕。在正常生理状态下，多数的肺成纤维细胞处于静息状态，而受到病理条件的刺激以后，肺成纤维细胞向炎症部位聚集，产生大量的炎症因子和炎症介质，同时细胞凋亡水平增加，造成组织损伤〔3〕。吸烟是诱导COPD发生的致病因素之一，肺成纤维细胞对香烟的烟雾较为敏感，香烟烟雾提取物(CSE)能够抑制肺成纤维细胞增殖，诱导细胞分泌炎症因子，促进细胞凋亡，造成细胞损伤〔4〕。微小RNA(miRNA)在人体内的几乎所有组织中均有表达，miRNA具有多种作用，参与生命体正常生理和病理过程，如细胞生长、凋亡、分化、代谢、糖尿病、肿瘤等〔5,6〕。miR-212-5p参与癌症、帕金森的发生〔7,8〕。有研究表明，miR-212-5p能够抑制心脏成纤维细胞增殖，在心肌纤维化中发挥抑制作用〔9〕。既往实验发现，miR-212-5p与COPD有关，miR-212-5p在COPD中表达下调，其能够抑制CSE诱导的气道上皮细胞凋亡〔10〕。目前对于miR-212-5p在CSE诱导的肺成纤维细胞炎症因子分泌和凋亡中的作用还不明确。本研究旨在探讨miR-212-5p在CSE诱导的肺成纤维细胞炎症因子分泌和凋亡中的作用和机制。

1 材料与方法

1.1材料 C-半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology；肿瘤坏死因子(TNF)-α含量检测试剂盒购自深圳市科润达生物工程有限公司；核因子(NF)-κB p65抗体购自美国Abcam；人胚肺成纤维细胞(MRC-5)购自无锡欣润生物科技有限公司；白细胞介素(IL)-8含量检测试剂盒购自上海康朗生物科技有限公司；miR-212-5p mimics和mimics control购自百奥迈科生物技术有限公司；IL-1β含量检测试剂盒购自武汉艾美捷科技有限公司。

1.2实验分组处理 MRC-5培养在含有10 ml/L链霉素和青霉素、10%胎牛血清的MEM细胞培养液中，细胞放在含有5%CO2、37℃的培养箱内培养，每48 h更换一次细胞培养液，细胞密度生长至70%以上，添加0.25%的胰蛋白酶消化传代。MRC-5中转染miR-212-5p mimics和mimics control，培养12 h以后，更换成含有5%的CSE细胞培养液继续培养，分别命名为CSE+miR-212-5p组和CSE+miR-NC组。细胞转染方法按照脂质体转染试剂Lipofectamine2000的操作说明书进行。将没有转染的MRC-5细胞用含有5%的CSE细胞培养液培养，命名为CSE组。把正常培养的MRC-5细胞设置为Control组。CSE的制备方法参照文献〔4〕，以烟雾发生器用去过滤嘴香烟负压抽吸，在出烟口的位置连接一根导管，使烟雾进入MEM中，然后用NaOH及HCL将pH调整到7.4，以0.22 pm的滤器过滤之后，为100%的CSE，在实验时根据要求稀释成5%的CSE。

1.3miR-212-5p表达检测 用实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测miR-212-5p表达。对照组、CSE组、CSE+miR-NC组、CSE+miR-212-5p组细胞培养24 h以后，在细胞内添加Trizol，分别提取各组细胞中的总RNA。用TE溶液对分光光度计进行校正，然后检测提取的RNA的OD260和OD280的比值。取RNA，进行逆转录反应，配制的逆转录反应体系如下：1 μg的RNA、1 μl的oligo(dT)中添加RNase free water至10 μl，在65℃反应5 min，然后继续加入1 μl的RNase抑制剂、1 μl的RT-primer、2 μl的dNTP mix，在42℃反应60 min，70℃反应5 min，4℃保存。PCR引物序列为：U6上游引物：CGAGCAGAGTCGCTTCA，下游：CTCGCTTCGGCAGCACATAT；miR-212-5p上游引物：CCTCGACTGGGGGTGTAAACAT，下游：-GTGGAGTCGATTGCGTGTC-3。收集1 μl的cDNA，添加0.5 μl的上游引物和下游引物、10 μl的SYBR Green master mix、8 μl的无水RNase，在95℃预变性8 min，95℃反应30 s，95℃反应5 s，60℃反应30 s，共进行40个循环。结果按照2-△△Ct法计算miR-212-5p的表达变化，U6为内参。

1.4细胞分泌炎症因子检测 用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎症因子IL-1β、IL-8、TNF-α水平。对照组、CSE组、CSE+miR-NC组、CSE+miR-212-5p组细胞培养24 h以后，收集细胞培养液上清，用IL-1β含量检测试剂盒、IL-8含量检测试剂盒、TNF-α含量检测试剂盒测定培养液上清中IL-1β、IL-8、TNF-α水平。

1.5细胞增殖活性检测 用CCK-8法检测细胞增殖活性。MRC-5接种到96孔板中，接种的密度为4×105个/ml，每个孔内添加150 μl的细胞悬浮液。按照对照组、CSE组、CSE+miR-NC组、CSE+miR-212-5p组分组方法处理并培养24 h以后，将细胞培养板取出，然后吸取10 μl的CCK-8工作溶液添加到每个孔内，将培养板再次放在37℃的培养箱内培养2 h。将酶标仪的波长设置为450 nm，测定每个孔的OD值，OD值表示细胞增殖活性。

1.6细胞凋亡变化检测 用流式细胞术检测细胞凋亡变化。对照组、CSE组、CSE+miR-NC组、CSE+miR-212-5p组细胞培养24 h以后，用胰蛋白酶消化细胞，2 600 r/min离心10 min后，将细胞收集，在细胞沉淀内添加适量的磷酸盐缓冲液(PBS)将细胞反复洗涤2次，然后在细胞内添加结合缓冲溶液400 μl，继续添加膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)工作溶液各5 μl，避光反应20 min以后，将细胞置于流式细胞仪中检测凋亡水平。

1.7Western印迹检测细胞中C-Caspase-3、NF-κB p65蛋白表达 空白组、CSE组、CSE+miR-NC组、CSE+miR-212-5p组细胞培养24 h以后，用胰蛋白酶消化细胞，2 600 r/min离心10 min后，将细胞收集。在细胞内添加提前加入PMSF的放射免疫沉淀法(RIPA)溶液，然后放在冰上充分裂解30 min。将裂解溶液转移到4℃离心机中，设置2 600 r/min离心10 min，将上清溶液收集并保存，蛋白存在于上清溶液中。吸取少量的蛋白溶液，用二喹啉甲酸(BCA)方法测定蛋白的浓度以后，在剩余的蛋白溶液中添加上样缓冲液，煮沸5 min。制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳电压设置为：浓缩胶80 V，分离胶100 V，溴酚蓝染料跑到底部之后，停止电泳。将凝胶取出并洗涤，放在转移缓冲液中浸泡。将聚偏氟乙烯(PVDF)膜根据目的蛋白在凝胶中的位置裁剪，同样浸泡在转移缓冲液中平衡。在冰上以60 V的电压转膜30 min。将PVDF膜取出，然后放在已经添加5%牛血清白蛋白的容器内，在室温中结合2 h。PVDF膜经TBST洗涤以后，再放在含有稀释以后的一抗孵育袋中，于4℃温度条件下结合过夜。再次用TBST将PVDF膜取出，然后放在含有稀释以后的二抗孵育袋中，在室温中结合2 h。按照电化学发光(ECL)显色试剂盒显色。GAPDH作为参照，分析目的蛋白的表达差异。

1.8NF-κB信号激活剂对miR-212-5p的作用检测 取转染miR-212-5p mimics以后的MRC-5细胞，用含有1 μmol/L的NF-κB信号激活剂PMA和5%的CSE细胞培养液培养，命名为CSE+miR-212-5p+PMA组，以CSE+miR-212-5p组为参照，利用ELISA(按照1.4中步骤操作)、CCK-8(按照1.5中步骤操作)、流式细胞术(按照1.6中步骤操作)、Western印迹法(按照1.7中步骤操作)分别检测细胞分泌的IL-1β、IL-8、TNF-α水平和细胞增殖、凋亡及C-Caspase-3、NF-κB p65蛋白表达变化。

1.9统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1miR-212-5p mimics提高CSE诱导的MRC-5细胞中miR-212-5p表达水平 CSE组MRC-5细胞中的miR-212-5p表达水平明显低于对照组(P<0.05)；CSE+miR-212-5p组MRC-5细胞中的miR-212-5p表达水平明显高于CSE+miR-NC组(P<0.05)。见表1。

2.2miR-212-5p对CSE诱导的MRC-5细胞炎症因子表达影响 CSE组MRC-5细胞分泌的IL-1β、IL-8、TNF-α水平明显高于Control组(P<0.05)；CSE+miR-212-5p组MRC-5细胞分泌的IL-1β、IL-8、TNF-α水平明显低于CSE+miR-NC组(P<0.05)。见表1。

2.3miR-212-5p对CSE诱导的MRC-5细胞增殖和凋亡影响 与Control组比较，CSE组MRC-5细胞增殖活性明显降低，细胞凋亡率和C-Caspase-3蛋白水平明显升高(P<0.05)；与CSE+miR-NC组比较，CSE+miR-212-5p组MRC-5细胞增殖活性明显升高，细胞凋亡率明显、C-Caspase-3蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。见表1、图1、图2。

表1 miR-212-5p mimics转染以后CSE诱导的MRC-5细胞miR-212-5p表达、分泌的IL-1β、IL-8、TNF-α水平、增殖活性、 凋亡率、NF-κB p65蛋白和C-Caspase-3蛋白水平

图1 流式细胞术检测MRC-5细胞凋亡

1～4：Control组，CSE组，CSE+miR-NC组，CSE+miR-212-5p组，图3同图2 Western印迹检测MRC-5细胞中 C-Caspase-3蛋白表达

2.4miR-212-5p对CSE诱导的MRC-5细胞NF-κB信号通路的影响 CSE组MRC-5细胞中NF-κB p65蛋白表达水平明显高于Control组(P<0.05)；CSE+miR-212-5p组MRC-5细胞中NF-κB p65蛋白表达水平明显低于CSE+miR-NC组(P<0.05)。见表1、图3。

图3 Western印迹检测各组NF-κB p65蛋白表达

2.5NF-κB信号激活剂对miR-212-5p影响CSE诱导条件下MRC-5细胞增殖、凋亡和分泌炎症因子的作用 与CSE+miR-212-5p组比较，CSE+miR-212-5p+PMA组细胞中NF-κB p65蛋白水平明显升高，细胞增殖活性明显降低，细胞凋亡率明显升高，细胞中C-Caspase-3蛋白表达明显增多，细胞分泌的IL-1β、IL-8、TNF-α明显增多(均P<0.001)。见图4、表2。

1,2：CSE+miR-212-5p组，CSE+miR-212-5p+PMA组

表2 NF-κB信号激活剂处理的转染miR-212-5p mimics以后的CSE诱导条件下 MRC-5细胞增殖活性、凋亡率及C-Caspase-3、NF-κB p65蛋白水平和分泌的IL-1β、IL-8、TNF-α水平

3 讨 论

肺成纤维细胞参与气道重塑过程。在气道重塑中，肺成纤维细胞产生大量的细胞因子如炎症因子，增加肺组织炎症反应，促进疾病进展〔11〕。CSE是肺成纤维细胞损伤的主要原因，CSE诱导肺成纤维细胞炎症因子释放、增殖抑制、细胞凋亡〔4〕。细胞释放的炎症因子一方面促进组织炎症损伤，另一方面还可以激活细胞凋亡途径，诱导细胞凋亡发生〔12〕。IL-1β、IL-8、TNF-α是常见的肺成纤维细胞分泌的炎症因子，其表达水平越高，炎症水平也就越高〔13〕。Caspase是与细胞凋亡有关的调控蛋白家族，其成员较多，在细胞凋亡中发挥促进作用〔14〕。Caspase蛋白成员在正常情况下以没有活性的酶原形式存在于细胞内，只有被激活后才可以诱导细胞凋亡的发生〔15〕。Caspase-3是细胞凋亡的执行因子，也是Caspase凋亡反应的下游因子，其活化后是细胞凋亡发生的重要标志之一〔16〕。本研究结果说明，CSE诱导肺成纤维MRC-5细胞凋亡和炎症因子释放，成功构建了肺成纤维细胞体外损伤模型。

miRNA是一类没有编码蛋白质功能的小分子RNA，没有开放阅读框，长度大约为20 nt，miRNA在多种生命体内均有表达，并且其参与调控不同细胞生长、分化、能量代谢、衰老等过程〔17〕。miRNA还是一个与疾病进展有关的多功能调控因子，在不同的病理过程中的作用不同〔18〕。有研究表明，miRNA与慢性阻塞性肺疾病进展有关，在肺组织炎症、细胞凋亡等过程中发挥关键功能〔19〕。miR-212-5p是一个多功能调控因子，广泛参与正常生理和病理过程，如miR-212-5p具有保护神经细胞损伤的作用，miR-212-5p在癌症进展中发挥抑制作用〔20，21〕。以前的研究发现，miR-212-5p参与成纤维细胞增殖调控，miR-212-5p在心肌梗死后心肌成纤维细胞中表达下调，并且miR-212-5p能够抑制心肌成纤维细胞增殖〔9〕。在慢性阻塞性肺疾病患者中发现miR-212-5p表达下调，且上调miR-212-5p具有改善疾病损伤的功能〔10〕。本实验显示，CSE诱导的MRC-细胞中miR-212-5p表达下调，并且上调miR-212-5p抑制CSE诱导的MRC-5细胞增殖抑制，凋亡促进和炎症因子分泌作用，miR-212-5p有改善CSE诱导的肺成纤维细胞炎症因子表达和细胞凋亡作用，这与以前的研究结果〔10〕相符合，说明miR-212-5p可能是COPD保护因子。

NF-κB是一种从淋巴B细胞中发现的核转录因子，在几乎所有的真核细胞中均有表达，NF-κB p65是NF-κB信号转导的关键亚单位，其表达水平的高低与NF-κB信号激活水平相关〔22〕。NF-κB是机体炎症反应的枢纽，与炎症因子分泌关系十分密切。另外，NF-κB还与细胞凋亡、细胞生长、稳态维持等有关〔23〕。研究发现，NF-κB在COPD疾病小气道重塑中发挥作用，NF-κB促进肺成纤维细胞分泌炎症因子和细胞凋亡〔24〕。本研究结果提示，miR-212-5p作用机制与NF-κB有关。