LC通过调控miR-4500表达对前列腺癌DU145细胞增殖及凋亡的影响

王洪 汪建平 刘晓东 汤祺

(云南大学附属医院(云南省第二人民医院)泌尿外科，云南 昆明 650021)

前列腺癌是临床常见的恶性肿瘤之一，目前发病机制尚未完全阐明，晚期患者主要通过放化疗手段治疗，但对症状缓解效果有限，患者远期生存时间较短且副作用较多，随着中医标准化治疗肿瘤的发展，研究表明中药单药有效成分对前列腺癌具有一定治疗效果，但作用靶点不同，其可调控细胞增殖及凋亡等生物学过程，但关于其作用机制尚未完全阐明〔1～3〕。细梗香草又称满山香，属于报春花科珍珠菜属植物，具有抗肿瘤等作用，其中细梗香草总皂苷(LC)是细梗香草的主要活性成分，研究发现LC可抑制肺癌细胞增殖及促进细胞凋亡〔4〕。但LC对前列腺癌的治疗效果及其可能作用机制尚未阐明。微小RNA(miRNA)广泛存在于人体内，常可作用于药物等治疗肿瘤的潜在靶点，研究发现人参皂苷Rh2通过调控miR-4295的表达从而抑制前列腺癌细胞生长〔5〕。miR-4500在膀胱癌中呈低表达并可促进膀胱癌形成及发展〔6〕。但miR-4500表达在LC抑制前列腺癌增殖中的作用尚未可知。基于此，本研究拟探讨LC对miR-4500表达的调控作用及前列腺癌DU145细胞在此过程中增殖及凋亡变化情况。

1 材料与方法

1.1临床标本 收集2018年5月至2019年2月云南省第二人民医院泌尿外科39例前列腺癌患者资料，患者均经临床组织病理检测，收集患者前列腺癌样本组织和匹配的邻近组织。人前列腺癌细胞DU145购自上海弘顺生物；细梗香草购自贵州艾力康中草药开发有限公司；Lipofectamine2000购自上海润成生物；噻唑蓝(MTT)试剂购自上海信帆生物；凋亡试剂盒购自北京博迈斯；Trizol试剂购自北京全式金生物；cDNA合成与qRT-聚合酶链反应(PCR)试剂购自美国Thermo Fisher。

1.2实验分组 LC〔7〕：取细梗香草药材(50 g)粉碎，使用70%乙醇回流提取，减压回收溶剂后加入蒸馏水溶解，使用正丁醇萃取后采用大孔树脂柱、中压十八烷基硅烷键合硅胶填料(ODS)柱色谱、硅胶柱色谱、高效液相色谱等技术手段提取与纯化单体化合物，应用波谱数据分析细梗香草提取物，鉴定出LC含量为65.08%，加入1%二甲基亚砜(DMSO)溶液进行溶解，制备母液为10 mg/ml的溶液，根据实验需要分别稀释至8、16、32 μg/ml。分别配制8、16、32 μg/ml三种剂量的LC设为LC-L组、LC-M组、LC-H组，分别加入对应标号的DU145细胞培养液中，对照组加入等量的药物稀释液。取miR-NC、miR-4500 mimics转染DU145细胞，设为miR-NC组、miR-4500组。取anti-miR-NC、anti-miR-4500转染至DU145细胞，设为LC+anti-miR-NC组、LC+anti-miR-4500组，并采用32 μg/ml LC处理细胞24 h。

1.3MTT检测细胞增殖 取各组DU145细胞接种于96孔板(5×103个/孔)，按照试剂盒说明书及应用酶标仪检测各孔光密度值(OD值)。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡率 取各组DU145细胞加入500 μl结合缓冲液重悬细胞，按照凋亡检测试剂盒说明书操作分别检测各组细胞凋亡率。

1.5qRT-PCR检测miR-4500的表达水平 采用Trizol法提取癌旁组织、前列腺癌组织及各组DU145细胞中总RNA，总RNA反转录合成cDNA(参照cDNA合成试剂盒说明书)，qRT-PCR扩增按照试剂盒说明书操作并应用罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪检测miR-4500相对表达量。

1.6Western印迹检测Ki-67、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达量 提取细胞总蛋白后检测蛋白浓度，取适量蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜、封闭2 h，分别孵育一抗稀释液(1∶1 000，美国Santa Cruz)24 h与二抗稀释液(美国Abcam，1∶2 000)1 h，用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.7统计学方法 采用SPSS21.0统计学软件进行独立样本t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1LC对前列腺癌DU145细胞增殖的影响 LC可明显抑制细胞增殖及Ki-67蛋白表达，且呈剂量依赖性(均P<0.05)，见图1、表1。

2.2LC对前列腺癌DU145细胞凋亡的影响 LC可明显促进细胞凋亡及Bax表达，明显抑制Bcl-2表达，且呈剂量依赖性(均P<0.05)，见表1、图2、图3。

图1 Western印迹检测Ki-67蛋白表达

表1 LC对前列腺癌DU145细胞增殖、凋亡及miR-4500表达的影响

图2 LC对前列腺癌DU145细胞凋亡的影响

图3 Western印迹检测Bcl-2、Bax蛋白表达

2.3LC对前列腺癌DU145细胞中miR-4500表达的影响 与对照组比较，LC-L组、LC-M组、LC-H组miR-4500的表达水平均显著升高，且各组比较差异均具有统计学意义(均P<0.05)，见表1。

2.4miR-4500在前列腺癌组织中的表达 前列腺癌组织中miR-4500的表达水平(0.30±0.03)显著低于癌旁组织(1.00±0.07；t=57.401，P<0.001)。

2.5miR-4500过表达对前列腺癌DU145细胞增殖和凋亡的影响 转染miR-4500 mimics可抑制细胞增殖及促进细胞凋亡，还可抑制Ki-67、Bcl-2表达而促进Bax表达(P<0.05)，见图4、表2。

1,2:LC+anti-miR-NC组,LC+anti-miR-4500组；图4同图4 miR-4500过表达对前列腺癌DU145细胞增殖和凋亡的影响

表2 miR-4500过表达对前列腺癌DU145细胞增殖和凋亡的影响

2.6抑制miR-4500表达逆转LC(32 μg/ml)对前列腺癌DU145细胞增殖和凋亡的作用 转染anti-miR-4500可拮抗LC对细胞增殖、凋亡及其相关蛋白表达(P<0.05)，见图5、表3。

图5 抑制miR-4500表达逆转LC对前列腺癌DU145细胞增殖和凋亡

表3 抑制miR-4500表达逆转了LC对前列腺癌DU145细胞增殖和凋亡的作用

3 讨 论

前列腺癌恶性程度高，部分患者确诊时已处于晚期导致其失去最佳治疗时机，接受化疗等治疗的患者有效率较低且存在一定副作用，因而寻找新型治疗药物对前列腺癌的治疗具有重要意义，随着植物化学学科的不断发展，中草药活性成分在抗肿瘤方面的药用效果已得到广泛证实，而相关的抗肿瘤机制尚待进一步阐明〔8～10〕。

LC可能通过调控半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的表达从而诱导胆管癌细胞凋亡〔11〕。LC具有抗肿瘤作用，其作用机制与调控机体免疫功能及抑制肿瘤血管新生有关〔12〕。LC可抑制胰腺癌细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡〔13〕。本研究结果显示，前列腺癌DU145细胞经LC处理后，细胞增殖速度明显受到抑制，且这种抑制作用随计量增加而增大。Ki-67高表达预示细胞增殖能力增强〔14〕。本研究发现LC可抑制Ki-67的表达，提示LC对前列腺癌DU145细胞增殖的抑制作用可能与Ki-67表达相关。Bcl-2/Bax比值降低可促进细胞凋亡〔15〕。本研究结果显示，LC可通过抑制Ki-67的表达促进前列腺癌细胞凋亡。miR-4500在结直肠癌中表达下调，并通过调节高迁移率蛋白(HMG)A2发挥新型肿瘤抑制作用〔16〕。miR-4500通过靶向胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(IGF2BP)1抑制人类神经胶质瘤细胞的进程〔17〕。熊果酸通过上调miR-4500表达及抑制Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)2/信号转导和转录激活因子(STAT)3磷酸化而诱导结直肠癌细胞凋亡〔18〕。本研究结果显示，抑制miR-4500的表达可明显逆转LC对前列腺癌DU145细胞的促凋亡作用。

综上，LC对前列腺癌DU145细胞的促凋亡与miR-4500上调相关，miR-4500未来可能作为新型抗肿瘤靶点辅助临床肿瘤治疗及药物科研发。