黄芪甲苷通过miR-126/NF-κB信号通路调控人牙龈成纤维细胞增殖及凋亡的分子机制

陈亚琼 高鹏 沈慧

(青海红十字医院口腔科，青海 西宁 810000)

牙周炎是常见的一种口腔疾病，炎症、氧化应激等均与牙周炎形成密切相关，人牙龈成纤维细胞(HGFs)是牙周膜与牙龈的主要细胞，可作为牙周支持组织的组成部分，并可诱导牙周组织再生，研究表明阿司匹林、积雪草酸等均可抑制HGFs细胞炎症反应〔1～3〕。黄芪甲苷属于豆科草本植物黄芪的主要活性成分，其具有抗炎的作用，并可促进间充质干细胞的成骨分化，研究表明黄芪甲苷可抑制NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白(NLRP)3炎症小体的活化而抑制人牙周膜细胞的炎症反应〔4〕。但黄芪甲苷对HGFs损伤的作用尚未阐明。miR-126在高糖诱导的HGFs中表达下调，并可靶向TNF受体关联因子(TRAF)6而抑制HGFs细胞中炎性因子的分泌〔5〕。核转录因子(NF)-κB信号通路被激活后可促进脂多糖(LPS)诱导的HGFs细胞炎症反应〔6〕。但黄芪甲苷是否可调控miR-126/NF-κB信号通路而参与牙周炎发生过程尚未可知。本文拟研究黄芪甲苷通过miR-126/NF-κB信号通路调控HGFs增殖及凋亡的分子机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 黄芪甲苷购自北京索莱宝科技有限公司(纯度≥98%)；NF-κB抑制剂PDTC购自美国Abcam；HGFs购自美国ATCC公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen；Trizol试剂购自北京全式金生物；反转录与荧光定量检测试剂购自北京天根生化；四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂、凋亡检测试剂盒购自美国Sigma；兔抗人周期素(Cyclin)D1、Cleaved-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗体购自美国CST；兔抗人p-p65、磷酸化抑制蛋白κBα(p-IкBα)抗体购自北京百奥莱博；二抗购自武汉艾美捷科技有限公司。

1.2实验分组 取对数生长期HGFs(2.5×105个/ml)接种于96孔板(100 μl/孔)，分别加入含有不同浓度(10、20、40 μg/ml)的黄芪甲苷培养液处理24 h〔7〕，分别记为10、20、40 μg/ml黄芪甲苷组。同时将正常培养的HGFs记为NC组。分别将miR-NC、miR-126 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-126转染入HGFs中，分别记为miR-NC组、miR-126组、anti-miR-NC组、anti-miR-126组。anti-miR-NC、anti-miR-126分别转染入HGFs后加入含有浓度为40 μg/ml黄芪甲苷的培养液处理24 h，分别记为40 μg/ml黄芪甲苷+anti-miR-NC组、40 μg/ml黄芪甲苷+anti-miR-126组。anti-miR-126转染入HGFs后加入NF-κB抑制剂PDTC 20 μmol/L〔8〕与40 μg/ml黄芪甲苷共同处理24 h，记为PDTC+40 μg黄芪甲苷+anti-miR-126组。

1.3MTT检测细胞增殖 收集各组HGFs(2.5×105个/ml)接种于96孔板(100 μl/孔)，按照MTT试剂盒说明书操作并检测各孔吸光度值(A值)。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡率 收集各组HGFs加入预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后弃上清，按照凋亡检测试剂盒说明书操作检测细胞凋亡率。

1.5实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞中miR-126的表达水平 采用Trizol法提取各组HGFs细胞总RNA，反转录合成cDNA，严格按照试剂盒说明书进行操作。按照qRT-PCR试剂盒说明书操作并检测miR-126相对表达量。

1.6Western印迹检测CyclinD1、Cleaved-Caspase-3、p-p65、p-IкBα蛋白表达 提取各组HGFs蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，转膜、封闭2 h，分别加入一抗稀释液(1∶1 000)与二抗稀释液(1∶2 000)，滴加电化学发光(ECL)显影后应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.7统计学分析 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1不同浓度黄芪甲苷对HGFs增殖、凋亡及miR-126表达的影响 与NC组比较，10、20、40 μg/ml黄芪甲苷组细胞活力、CyclinD1蛋白水平及miR-126表达水平升高，凋亡率及Cleaved-Caspase-3蛋白水平降低，差异有统计学意义(均P<0.05)，见表1、图1、图2。

2.2miR-126对HGFs增殖、凋亡的影响 与miR-NC组比较，miR-126组miR-126、CyclinD1蛋白及细胞活力升高，Cleaved-Caspase-3蛋白表达及细胞凋亡率下降，与anti-miR-NC组比较，anti-miR-126组miR-126、CyclinD1蛋白及细胞活力下降，Cleaved-Caspase-3蛋白及细胞凋亡率升高，差异有统计学意义(均P<0.05)，见图3、表2。

表1 不同浓度黄芪甲苷对HGFs增殖、凋亡及miR-126表达的影响

图1 不同浓度黄芪甲苷对HGFs凋亡的影响

1～4:NC组,10 μg/ml黄芪甲苷组，20 μg/ml黄芪甲苷组，40 μg/ml黄芪甲苷组图2 各组CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达

1～4：miR-NC组,miR-126组,anti-miR-NC组,anti-miR-126组图3 Western印迹检测各组CyclinD1、 Cleaved-Caspase-3蛋白的表达

表2 miR-126对HGFs增殖、凋亡的影响

2.3anti-miR-126减弱黄芪甲苷对HGFs增殖、凋亡的影响 与40 μg/ml黄芪甲苷+anti-miR-NC组比较，40 μg/ml黄芪甲苷+anti-miR-126组miR-126、CyclinD1蛋白及细胞活力下降，Cleaved-Caspase-3及细胞凋亡率升高，差异有统计学意义(均P<0.05)，见表3、图4。

表3 anti-miR-126减弱黄芪甲苷对HGFs增殖、凋亡的影响

2.4HGFs中NF-κB信号通路蛋白的表达 与NC组比较，40 μg/ml黄芪甲苷组p-p65、p-IкBα蛋白水平降低(均P<0.05)，anti-miR-126组p-p65、p-IкBα蛋白水平升高(均P<0.05)；与40 μg/ml黄芪甲苷+anti-miR-NC组比较，40 μg/ml黄芪甲苷+anti-miR-126组p-p65、p-IкBα蛋白水平升高(均P<0.05)，见图5、表4。

1～2：40 μg/ml黄芪甲苷+anti-miR-NC组,40 μg/ml黄芪甲苷+anti-miR-126组图4 Western印迹检测CyclinD1、 Cleaved-Caspase-3蛋白的表达

1～5：NC组,40 μg/ml黄芪甲苷组，anti-miR-126组,40 μg/ml黄芪甲苷+anti-miR-NC组,40 μg/ml黄芪甲苷+anti-miR-126组图5 Western印迹检测p-p65、p-IкBα蛋白的表达

表4 HGFs中NF-κB信号通路蛋白的表达

2.5NF-κB抑制剂PDTC逆转anti-miR-126对黄芪甲苷对HGFs增殖、凋亡的影响作用 与40 μg/ml黄芪甲苷+anti-miR-126组比较，PDTC+40 μg/ml黄芪甲苷+anti-miR-126组细胞活力与CyclinD1蛋白水平升高(均P<0.05)，凋亡率、Cleaved-Caspase-3、p-p65/p-IκBα蛋白水平降低(均P<0.05)，见图6、表5。

1，2：40 μg/ml黄芪甲苷+anti-miR-126组,PDTC+40 μg/ml黄芪甲苷+anti-miR-126组图6 Western印迹检测p-p65、p-IкBα、 CyclinD1、Cleaved-Caspase-3蛋白的表达

表5 NF-κB抑制剂PDTC逆转anti-miR-126对黄芪甲苷对HGFs增殖、 凋亡的影响作用

3 讨 论

牙周炎是一种牙周支持组织慢性炎症性疾病，其主要是由于菌斑微生物感染引起的一种疾病，牙周局部组织中可激活炎症反应从而破坏牙槽骨，既往研究显示，藜芦酸抑制HGFs细胞中LPS诱导的白细胞介素(IL)-6和IL-8产生〔9〕。槲皮素通过抑制NF-κB信号通路抑制HGFs中LPS诱导的炎症反应〔10〕。冬凌草甲素通过激活过氧化物酶增殖物激活受体(PPAR)γ抑制LPS诱导的HGFs炎症反应〔11〕。

黄芪甲苷具有抗炎、抗氧化、降血糖等作用，并可保护糖尿病肾脏，研究表明黄芪甲苷可抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡〔12〕。黄芪甲苷可能通过抑制Capase-3表达而抑制细胞凋亡从而减轻大鼠肝星状细胞氧化损伤〔13〕。本研究结果显示，黄芪甲苷可明显增强HGFs活力，并可促进HGFs的增殖及CyclinD1的表达。本研究结果显示，黄芪甲苷可降低HGFs凋亡率，并可抑制Cleaved-Caspase-3的表达，提示黄芪甲苷可抑制HGFs凋亡。

本研究提示黄芪甲苷可能通过上调miR-126的表达从而发挥作用。miR-126表达上调可减轻LPS诱导的胰腺炎症损伤〔14〕。芒果多酚可抑制miR-126/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素蛋白(mTOR)轴而减轻结肠炎的炎症〔15〕。本研究结果显示，miR-126过表达可明显提高HGFs活力，而降低细胞凋亡率，抑制miR-126表达可降低HGFs活力，而提高细胞凋亡率。本研究结果显示，抑制miR-126表达与黄芪甲苷联合处理后，HGFs活力降低，而凋亡率升高。miR-424过表达可靶向碱性成纤维细胞生长因子(FGF)2而抑制NF-κB途径从而抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症〔16〕。牙周组织处于炎症状态时，NF-κB-p65核内转后与下游靶基因结合，进而促进IL-6等炎性细胞因子表达〔17〕。姜黄素可通过髓系细胞触发受体(TREM)2/Toll样受体(TLR)4/NF-κB途径促进小胶质细胞M2极化，从而抑制LPS诱导的神经炎症反应〔18〕。本研究结果显示，黄芪甲苷可降低HGFs中p-p65、p-IкBα蛋白水平，抑制miR-126表达可提高HGFs中p-p65、p-IкBα蛋白水平，而黄芪甲苷与抑制miR-126表达联合作用后HGFs中p-p65、p-IкBα蛋白水平升高，提示黄芪甲苷可能通过调控miR-126/NF-κB通路而发挥作用。同时本研究进一步分析显示，NF-κB抑制剂PDTC、黄芪甲苷与抑制miR-126表达联合作用后，HGFs活力升高，而凋亡率降低，提示黄芪甲苷可通过miR-126/NF-κB信号通路而发挥作用。

综上，黄芪甲苷可通过上调miR-126的表达而抑制NF-κB信号通路的活化从而促进HGFs增殖及抑制细胞凋亡，miR-126可能作为黄芪甲苷治疗牙周炎的潜在靶点，还可为进一步揭示黄芪甲苷治疗牙周炎的分子机制奠定实验基础。