基于TGF-β/Smads信号通路探究红景天提取物对肺癌模型大鼠的干预效果

黄敏 朱立成 吴传中

(1南通大学附属医院中医科，江苏 南通 226000；南通市第三人民医院 2呼吸内科；3老年科)

肺癌是目前严重威胁人类健康的疾病之一，目前临床上多采用早期手术、化疗、放疗为主要治疗手段，但早期手术治疗的效果并不理想，多数患者存在病灶复发的现象，因此多在术后联合化疗治疗，研究显示，化疗可在一定程度上提高肺癌患者5年生存率，但存在明显的血液、肝脏等毒副作用〔1,2〕。肺癌的进展与癌细胞增殖失调，迁移加剧相关，随着临床上对肺癌转移的机制的深入研究发现，肺癌的进展与转化生长因子(TGF)-β/Smads信号通路相关，此信号通路具有促进细胞外基质增生，原发性肿瘤转移的作用，在肺癌进展过程中具有重要的作用〔3,4〕。在本文研究中将红景天提取物应用于肺癌模型中，分析其对肺癌的作用及是否经TGF-β/Smads信号通路抑制肺癌的进展。

1 材料与方法

1.1材料 研究动物：选取90只Wistar大鼠，雌雄各半，购自慕恩(广州)生物科技有限公司，动物许可证号：SYXK(粤)2020-0225，18～20月龄，平均体重(302.25±25.75)g，在30%～35%相对湿度、(23.8±1.5)℃的环境中喂养7 d，光照12 h/d，分笼饲养。本研究获医院伦理委员会批准，实验操作严格按照动物实验伦理要求相关规定进行。

主要试剂：链霉素(山东鲁抗医药股份有限公司)；青霉素(华北制药股份有限公司)；环磷酰胺(江苏盛迪医药有限公司)；碘油(郑州派尼化学试剂)；癌抗原(CA)125酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海群己生物科技有限公司)；癌胚抗原(CEA)ELISA试剂盒(艾美捷科技有限公司)；小鼠抗大鼠波形蛋白(Vimentin)抗体(武汉益普生物科技有限公司)；兔抗大鼠E-钙黏附蛋白(Cadherin)抗体(上海研卉生物科技有限公司)；小鼠抗大鼠TGF-β1抗体(艾美捷科技有限公司)；兔抗人Smad3抗体(武汉益普生物科技有限公司)；兔抗大鼠B细胞淋巴瘤(Bcl)-2抗体(武汉益普生物科技有限公司)；兔抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3抗体(艾美捷科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1红景天提取物制备 将红景天放置于烘干箱中做烘干处理后粉碎，行超声提取液冷却、滤过、回收乙醇，加30倍量水做洗脱处理后使用30%乙醇洗脱、浓度、真空干燥，得到红景天提取物，配制为0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml 3个低、中、高剂量，备用。

1.2.2分组及建模 将所选取的90只大鼠分为A组(正常组)、B组(模型组)、C组(环磷酰胺组)各15只，D组(红景天组)45只，B组、C组、D组均参照陈稀烦等〔5〕研究中肺癌模型的建立方法构建肺癌大鼠模型，制备致癌碘油液：将6.4 ml碘油、1.6 ml二乙基亚硝胺、1.2 g三甲基胆蒽混合均匀后放置于70℃的水浴箱中做孵育处理，孵育12 h后所得到的乳状液即为致癌碘油液。在大鼠建模前3 d肌注45 mg链霉素、2万U的青霉素，以避免建模过程中感染的发生提高建模成功率。建模：大鼠腹腔注射水合氯醛做常规麻醉处理后将其仰卧固定于操作平台上，使用手术缝线固定上齿促使大鼠喉部肌肉处于松弛的状态，使用无齿镊将舌缓慢拉出，在额镜的辅助下将0.1 ml致癌碘油液灌注于左肺叶支气管处，灌注结束后自由摄食饲养。A组在此过程中不做任何处理。

1.2.3给药 在灌注致癌碘油液后第2天A组、B组腹腔注射0.5 ml/kg的0.9%氯化钠(Nacl)，C组腹腔注射0.5 ml/kg的环磷酰胺注射液，D组分为E组(低剂量红景天)、F组(中剂量红景天)、G组(高剂量红景天)3个亚组，大鼠分别腹腔注射0.5、1.0、2.0 mg/(ml·kg)的红景天提取物，各组大鼠均每日注射1次，连续注射8 w，观察变化。

1.2.4肿瘤体积、质量评价 在末次给药1 d后采取大鼠2 ml尾部静脉血后常规麻醉处死大鼠，迅速取肺癌组织，测量肺癌组织最长径、最短径，计算肿瘤体积，肿瘤体积=(最长径×最短径2)/2，并称量肿瘤重量，计算抑瘤率，抑瘤率=(1-治疗组平均肿瘤质量/B组平均肿瘤质量)×100%。上述操作完成后将肺癌组织均匀分为3等份，分别做病理组织学观察、肺癌细胞分离和蛋白检测。

1.2.5病理组织学观察 取所获取的肺癌组织，固定1 d后，使用酒精脱水、二甲苯透明处理后做常规石蜡包埋，做5 μm切片，做苏木素-伊红(HE)染色，树胶封片后使用光学显微镜观察大鼠肺组织病理变化。

1.2.6肿瘤标志物水平检测 将所抽取的2 ml尾部静脉血分离血清，使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清肿瘤标志物CA125、CEA水平。

1.2.7肺癌细胞增殖活性检测 将所取得的肺癌组织分离出肺癌细胞，采用CCK-8法测定大鼠肺癌细胞增殖活性，取对数生长期细胞，将其接种于96孔板内，细胞浓度为2×107/L，在温度为37℃的培养箱中进行培养，培养2 h后使用酶标仪记录450 nm波长处的吸光值，取其中4孔光密度(OD)均值，计算各组癌细胞增殖活性，增殖率(%)=(OD处理组-OD空白组)/(OD对照组-OD处理组)×100%。

1.2.8肺癌细胞凋亡情况检测 采用TUNEL法检测大鼠肺癌细胞凋亡率，将所获得的细胞使用磷酸盐缓冲液(PBS)震荡后使用PBS重复洗涤3次，每次洗涤时间为5 min，使用0.1% Triton X-100打孔，完成后再次使用PBS重复洗涤3次，根据TUNEL试剂盒操作说明做1号、2号液混合，在避光、37℃的条件下孵育1 h后，使用PBS重复洗涤3次。在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况并进行计数，经洗涤、4′,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)染色封片后的细胞核分别呈现为阳性和阴性，其中颜色分别为绿色荧光和蓝色荧光，重复进行3次并取平均值。细胞凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.9肺癌细胞迁移能力检测 采用细胞划痕实验检测大鼠肺癌细胞迁移能力，将细胞接种至18孔板带其增长到80%时，使用100 μl的枪头,垂直划出3条直线，使用PBS清洗2～3次，分别加入0.5%的血清培养基，观察24 h之后，使用倒置显微镜观察各组细胞的迁移数量。

1.2.10肺组织上皮间质转化(EMT)相关蛋白、TGF-β/Smads信号通路蛋白表达量检测 采用Western印迹检测大鼠肺组织EMT相关蛋白Vimentin、E-Cadherin、TGF-β/Smads信号通路蛋白TGF-β1、Smad3、Bcl-2、Caspase-3表达量，将肺癌组织离心处理10 min，提取上清液，二喹啉甲酸(BCA)进行蛋白定量检测，在十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶缓冲液中加入50 μg蛋白，100℃加热5 min，凝胶电泳、转膜，取膜，4 ℃环境下在5%脱脂牛奶中固定、封闭处理时间为1 h，将一抗使用0.05%～0.10% TBST给予稀释(Vimentin、E-Cadherin、TGF-β1、Smad3、Bcl-2、Caspase-3一抗为1∶1 000)，4℃孵育过夜保存，之后使用0.05%～0.10% TBST洗膜，3次，每次为5 min，二抗被0.05%～0.10% TBST稀释(1∶10 000)，摇动孵育时间为1 h，再次采用TBST连续洗膜3次，处理时间为5 min，二氨基联苯胺(DAB)显色，定量分析蛋白表达情况，以GAPDH为内参。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组肿瘤体积、肿瘤重量、抑瘤率对比 与B组相比，C、E、F、G组肿瘤体积、肿瘤重量明显降低(P<0.05)；与C组相比，E、F、G组肿瘤体积、肿瘤重量明显降低，抑瘤率明显升高，且随着红景天剂量增加肿瘤体积、肿瘤重量明显降低、抑瘤率明显升高(P<0.05)。见表1。

2.2各组病理组织学观察 A组大鼠肺组织无病理改变，细胞结构正常；B组大鼠上皮细胞受到严重损伤，肺泡损伤，肺泡壁细胞呈深染、不规则的细胞核；C、E、F、G组大鼠肺泡损伤程度较B组明显减轻，细胞核形态结构基本恢复正常，且随着D组各亚组(E组、F组、G组)用药剂量的增加，肺病理变化改善程度越来越明显，接近于正常。见图1。

表1 各组肿瘤体积、肿瘤重量、抑瘤率、血清肿瘤标志物水平对比

图1 各组病理组织学观察(HE染色，×400)

2.3各组血清肿瘤标志物水平对比 与A组相比，B、C、E、F、G组CA125、CEA水平明显升高(P<0.05)；与B组相比，C、E、F、G组CA125、CEA水平明显降低(P<0.05)；与C组相比，E、F、G组CA125、CEA水平明显降低，且随着红景天剂量增加CA125、CEA表达明显降低(P<0.05)。见表1。

2.4各组癌细胞增殖率、凋亡、迁移能力对比 与B组相比，C、E、F、G组癌细胞增殖率、迁移数量明显降低，凋亡率明显升高(均P<0.05)；与C组相比，E、F、G组癌细胞增殖率、迁移数量明显降低，凋亡率明显升高，且随着红景天剂量增加，各项指标变化程度更为显著(均P<0.05)。见表2。

2.5各组肺组织EMT相关蛋白表达情况对比 与A组对比，B、C、E、F、G组Vimentin蛋白表达量明显升高，E-cadherin蛋白表达量明显降低(P<0.05)；与B组相比，C、E、F、G组Vimentin蛋白表达量明显降低，E-cadherin蛋白表达量明显升高(P<0.05)；与C组相比，E、F、G组Vimentin蛋白表达量明显降低，E-cadherin蛋白表达量明显升高，且随着红景天剂量增加表达水平的变化程度更为显著(P<0.05)。见表2、图2。

表2 各组癌细胞增殖率、凋亡、迁移能力、肺组织EMT相关蛋白表达情况对比

图2 Western印迹检测EMT相关蛋白表达

2.6各组肺组织TGF-β/Smads信号通路蛋白表达量对比 与A组相比，B、C、E、F、G组TGF-β1、Smad3、Caspase-3蛋白表达量明显降低，Bcl-2蛋白表达量明显升高(P<0.05)；与B组相比，C、E、F、G组TGF-β1、Smad3、Caspase-3蛋白表达量明显升高，Bcl-2蛋白表达量明显降低(P<0.05)；与C组相比，E、F、G组TGF-β1、Smad3、Caspase-3蛋白表达量明显升高，Bcl-2蛋白表达量明显降低，且随着红景天剂量增加表达水平的变化程度更为显著(P<0.05)。见图3、表3。

图3 Western印迹检测TGF-β/Smads信号通路蛋白表达

表3 各组肺组织TGF-β/Smads信号通路蛋白表达量对比

3 讨 论

肺癌包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌两种类型，其中以非小细胞肺癌发病率最高，肺癌发生后其疾病进展较为迅速，较易转移，且部分患者预后较差，究其原因可能与临床用药不能有效作用于疾病进展相关作用靶点相关〔6,7〕。

红景天分布较为广泛，作为药用植物用药历史悠久，其在民间被称为“黄金根”，可见其具有较为重要的药用价值〔8〕。临床研究发现，红景天中含有多种化学物，其中以红景天苷为主的红景天提取物已经逐渐被临床上证实具有多种药理作用，目前药理试验已经证实红景天提取物具有抗抑郁、抗衰老、抗疲劳、预防高原病及抗恶性肿瘤等多种药理作用〔9〕。王也夫等〔10〕、罗兰〔11〕、韩何丹等〔12〕在其研究中发现红景天提取物具有抗慢性束缚应激所致大鼠焦虑障碍、运动小鼠抗氧化能力、顺铂致肾细胞毒性的保护作用等多种作用。另外有体外试验发现，红景天提取物可抑制肿瘤细胞活性，促进肿瘤细胞凋亡，发挥其抵抗肿瘤进展的作用。本研究结果提示，红景天提取物可能剂量依赖性的抑制肺癌肿瘤生长，抑制疾病进展。

TGF-β内含6个半胱氨酸残基，包括BMP/GDF/Mis亚家族、TGF-β/Actinvin/Nodal亚家族两个亚家族，TGF-β1属于其成员之一，属于一种促进肺癌转移和侵袭的指标，在肺癌发生初期其作为一种肿瘤抑制因子可抑制癌细胞增殖，但在肺癌晚期其可经促进癌细胞增殖、分化、迁移促进疾病进一步发展〔13～15〕。TGF-β/Smads信号通路是由膜结合的Ⅰ型受体、Ⅱ型受体与Smad蛋白所组成的复合物相关，上述受体可与Smad蛋白在Ⅰ型受体的丝氨酸-苏氨酸激酶结构域下相互作用〔16〕。临床研究发现，TGF-β可经诱导Smad3的磷酸化，介导炎性信号通路的传导作用促进上皮间质转化的发生，与癌细胞增殖、迁移相关。Smad3在TGF-β的诱导作用下发生磷酸化，使得磷酸化的Smad3进入至核内，可经与相对应的作用靶点相结合后发生其多种生物学效应〔17,18〕。有研究发现，TGF-β/Smads信号通路在肺癌发生、癌细胞迁移、上皮间质转化、衰老等过程相关〔19，20〕。一项研究显示，TGF-β1/Smads可经调控上皮间质转化蛋白E-cadherin、Vimentin等表达，参与肺癌进展〔21〕。本研究结果提示，红景天提取物经激活肺癌TGF-β/Smads信号通路，上调E-cadherin、Caspase-3表达，抑制Vimentin、Bcl-2表达相关，呈剂量依赖。