miRNA-21对结直肠癌耐药细胞ATM/CHK2/CDC25A信号通路的影响

严晓丽 范彦芳 严鹏 薛晶 郑纪宁

(承德医学院，河北 承德 067000)

美国癌症协会2021年最新癌症评估数据显示，大肠癌发病率和死亡率在男性和女性中均位居第三位〔1〕。在我国结直肠癌发病率和死亡率均保持上升趋势，2018年中国癌症统计报告显示，中国已成为全球结直肠癌每年新发病例数和死亡病例数最多的国家〔2〕。奥沙利铂(L-OHP)是临床治疗中晚期结直肠癌的一线化疗药物，并已被推荐列入Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌的辅助治疗和复发/转移性结直肠癌的术前治疗和全身系统治疗方案中〔2〕。但结直肠癌患者对L-OHP产生耐药是导致化疗疗效明显降低甚至化疗失败的一个主要原因。为了提高中晚期结直肠癌患者的预期寿命和生活质量，通过寻找新的生物标志物逆转L-OHP化疗耐药将有助于改善患者预后和治疗方案的选择。L-OHP主要通过破坏癌细胞DNA结构和功能阻止癌细胞的分裂和增殖，而DNA结构损伤主要和毛细血管扩张性共济失调突变基因(ATM)/细胞周期检测点激酶(CHK)2/细胞周期分裂素(CDC)25A信号通路有关。有研究显示miRNA-21与以L-OHP为基础化疗方案的肿瘤患者的疗效及预后密切相关〔3,4〕，但miRNA-21是否主要通过调控ATM/CHK2/CDC25A通路参与L-OHP化疗耐药目前尚不清楚。因此，本实验通过研究结直肠癌L-OHP耐药细胞株HCT116/L-OHP中miRNA-21与该信号通路中的关键因子ATM、CHK2、CDC25A、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)2的关系，探讨miRNA-21是否主要通过调控该信号通路参与结直肠癌细胞L-OHP的耐药，进而为临床L-OHP耐药提供新的生物治疗靶点。

1 材料与方法

1.1材料 HCT116/L-OHP购于上海博谷生物科技有限公司，胎牛血清(FBS)购于BI公司，RPMI1640培养基与胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA,0.05%)购于Gibco公司。总RNA抽提试剂(TRIZOL)购于Invitrogen科技公司，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒购于天根生化科技有限公司，茎环法miRNA RT-PCR 定量试剂盒和茎环法miRNAs荧光扩增试剂盒均购于苏州吉玛基因公司。miRNA-21引物序列、miRNA-21模拟物(mimics)、miRNA-21抑制剂(inhibitors)及相应的阴性对照序列均由吉玛基因公司设计合成，其余因子引物序列由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成。RIPA裂解液购于索莱宝科技有限公司，ATM、β-actin兔抗人单克隆抗体购于ABclonal公司，CHK2、CDK2兔抗人单克隆抗体、CDC25A兔抗人多克隆抗体及二抗羊抗兔均购于碧云天生物技术有限公司，电化学发光(ECL)液购于北京普利莱基因技术有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 HCT116/L-OHP细胞采用含10%FBS的RPMI1640完全培养基在37℃、5% CO2的细胞孵育箱内培养，待细胞覆盖率达培养皿底的85%～90%时，用胰蛋白酶消化，以1∶3比例进行传代。

1.2.2细胞分组及转染 将细胞分为五组：空白对照(NC)组、mimics阴性对照(MNC)组、mimics组、inhibitors阴性对照(INC)组、inhibitors组。空白对照组不进行转染处理，MNC组转染miRNA-21 mimics 阴性对照序列，mimics组转染miRNA-21 mimics序列，INC组转染miRNA-21 inhibitors 阴性对照序列，inhibitors组转染miRNA-21 inhibitors序列。取对数生长期细胞，以密度约1×106个/孔的细胞数接种于6孔板中，待细胞汇合至70%～80%后进行转染。转染时配液：A液(Lipo2000 5 μl+无血清培养基250 μl)/孔×4个转染组，室温静置5 min，B液(MNC/Mimics/INC/Inhibitors转染序列各5 μl+无血清培养基250 μl)/孔，混合各转染组的A液与B液后，室温静置20 min，分别将各组的AB混合液滴加至相应的6孔板中，转染24 h后，细胞基本融合至85%～95%，收集细胞。

1.2.3RT-qPCR检测相关因子mRNA表达水平 细胞RNA提取：待培养的细胞覆盖率达80%～90%时，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞3次，用TRIZOL提取细胞总RNA。RNA浓度采用Nanodrop 2000分光光度计进行检测，样品纯度A260/A280比值在1.8～2.1范围内为符合标准的RNA。独立重复实验3次，每次实验每个样品做2个复孔，复孔间Ct值差异<1。以2-ΔΔCt判定目的基因的表达在实验组中相对于对照组中的变化倍数，其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct内参基因)实验组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组。引物序列：miRNA-21正义链5′-TCGCCCGTAGCTTATCAGACT-3′,反义链5′-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3′;U6 snRNA正义链5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′,反义链5′-GGAA CGCTTCACGAATTTG-3′;ATM正义链5′-ATTGGCTTATACGCGCAGTG-3′,反义链5′-TAGAGATTCTGGATCTCCGTCA-3′;CHK2正义链5′-CTCGGG-ATGCGGATGTTGAG-3′,反义链5′-TGCTGGTAGAGGAGCTGGAT-3′;CDC25A正义链5′-ACCTCAGA-AGCTGTTGGGATG-3′,反义链5′-GTCCTAGAGAGTGCAGGCAG-3′;CDK2正义链5′-TGGACACTGAG-ACTGAGGGTGT-3′,反义链5′-TCTTGATGAGGGGAAGAGGAAT-3′;GAPDH正义链5′-GCACCGTCA-AGGCTGAGAAC-3′,反义链5′-TGGTGAAGACGCC AGTGGA-3′。

1.2.4Western印迹实验 取各组对数生长期的细胞，用RIPA裂解各组细胞提取总蛋白，酶标仪测定蛋白浓度。取30 μg蛋白样品上样量进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜200 mA恒流转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，ATM、CHK2、CDC25A、CDK2一抗均以1∶1 000浓度稀释、β-actin一抗(1∶100 000稀释)4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，15 min/次，二抗(1∶1 000稀释)室温孵育2 h，TBST洗膜3次，10 min/次，ECL液显影拍照。重复3次实验。图像采用Quantity One软件进行灰度值分析，以目的蛋白条带与内参条带的灰度值比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.3统计学分析 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

各组ATM、CHK2、CDC25A、CDK2 mRNA及蛋白表达比较 mimics组中ATM、CHK2、CDC25A和CDK2 mRNA及蛋白表达均明显高于MNC组与NC组(P<0.05)；MNC组与NC组相比较，各因子 mRNA及蛋白表达水平的差异均不具有统计学意义(P>0.05)。inhibitors组中ATM、CHK2、CDC25A和CDK2 mRNA的表达均明显低于INC组(P<0.05)；INC组与NC组相比较，各因子 mRNA及蛋白表达水平差异均不具有统计学意义(P>0.05)。见表1、图1。

表1 各组ATM、CHK2、CDC25A 和CDK2 mRNA及蛋白表达比较

图1 β-actin、ATM、CHK2、CDC25A、CDK2 蛋白在 各组中的表达

3 讨 论

肿瘤的放化疗治疗多是通过诱导肿瘤细胞DNA损伤来消除肿瘤细胞。L-OHP作为一种抗肿瘤药物被广泛应用于治疗各种癌症，包括结直肠癌，但肿瘤细胞对L-OHP化疗产生耐药性限制了L-OHP的疗效和临床应用。L-OHP属于第三代铂类化疗药物，其杀伤肿瘤细胞的机制主要是通过与DNA形成加合物，引起DNA链间、链内及DNA-蛋白质交联，干扰DNA结构和功能，致使DNA双链在转录和翻译过程中无法解开，阻止癌细胞的分裂和增殖，最终导致细胞周期阻滞和细胞凋亡〔5，6〕。DNA结构损伤主要和ATM/CHK2/CDC25A信号通路有关。ATM基因编码的蛋白是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，当细胞受到内外环境的不良刺激如L-OHP作用后DNA发生损伤，ATM会发生磷酸化进而诱导多个底物包括CHK2磷酸化，进一步放大DNA损伤信号并激活CDC25A。正常情况下，CDC25A在细胞分裂中期是稳定的，而在分离中期结束后便被降解。DNA损伤后，CDC25A会特异性降解，从而导致细胞周期阻滞。研究表明，CDC25A表达增强与肿瘤细胞化疗耐药密切相关，机制是通过减少G2/M期阻滞而增强了化疗耐药性，并且沉默CDC25A或用CDC25A抑制剂治疗可以逆转肿瘤细胞的耐药性〔7〕。

研究发现，肿瘤抑制因子miRNAs可以增强肿瘤细胞对L-OHP化疗的敏感性，触发细胞凋亡和细胞周期阻滞，导致肿瘤细胞活力下降和肿瘤进展，一些miRNAs还能提高L-OHP化疗的疗效〔8〕。miRNA-21 是一种癌基因，其高表达与肿瘤的发生发展、转移预后、化疗耐药等均有密切关系。研究〔9～11〕显示，miRNA-21高表达的大肠癌患者整体生存率和无病生存率较miRNA-21低表达患者明显下降，miRNA-21在大肠癌组织中的表达水平对于患者的整体生存和无病生存是一个独立的预后因素。

本实验结果表明，HCT116/L-OHP细胞株中miRNA-21的表达受到干预后，ATM/CHK2/CDC25A通路中关键分子的表达也随之发生变化。过表达miRNA-21时可促进ATM的表达和下游一系列底物CHK2、CDC25A、CDK2的表达；当miRNA-21表达降低时，ATM的表达和下游一系列底物CHK2、CDC25A、CDK2的表达水平均随之下降，说明miRNA-21参与结直肠癌L-OHP化疗耐药的作用很可能和ATM/CHK2/CDC25A信号通路有关。抑制miRNA-21的表达可阻断ATM/CHK2/CDC25A信号通路，进而抑制耐药细胞的无限增值。推测抑制miRNA-21将有可能成为结直肠癌L-OHP化疗耐药新的治疗靶点，这也为进一步研究L-OHP的耐药机制提供了许多预测，但这还需后续的实验进行进一步的研究验证。