沉默miR-146a对颈动脉狭窄模型大鼠血管平滑肌细胞活性的影响及机制

池魁 袁涛 孙欢欢 李烨 张金文

(河北医科大学第二医院 1血管外科，河北 石家庄 050000；2麻醉科)

颈动脉可以将心脏部位的血液输送到人体的大脑、头部、面部中〔1,2〕。当血液中出现沉积物时，就会造成某一个部位的血管变窄，血管壁会随着病情的严重程度越来越窄，当达到完全阻塞血流时，就会诱发脑卒中疾病〔3〕。血管平滑肌细胞是构成平滑肌的一种组织，是较横纹肌原始的一种肌肉，主要分布在人体内脏器官内，是可以单独存在的，但是大部分的平滑肌细胞都是成层或者成束分布的。其中平滑肌的细胞骨架系统是比较发达的，主要是由中间丝、密体、密斑组成。细胞周边部的肌浆中，含有粗细两种肌丝。研究发现，动脉粥样硬化、冠脉旁路移植术等的特征均为血管平滑肌细胞增生及异常迁移〔4〕。目前临床缺乏有效治疗颈动脉狭窄的方法，因此发现有效诊治颈动脉狭窄具有重要的意义。本研究主要探讨沉默miR-146a对颈动脉狭窄模型大鼠血管平滑肌细胞活性的影响及机制。

1 材料与方法

1.1材料 研究动物：48只SPF级SD大鼠，购自商丘美兰生物工程有限公司〔动物许可证号：SYXK(豫)2022-0006〕，4～6月龄，平均(4.75±0.95)月龄，体重230～320 g，平均(261.25±42.75)g，光照12 h/d，在湿度25%～36%、温度为25～27℃的温度中喂养大鼠1 w。本研究经河北医科大学第二医院动物实验伦理委员会批准通过。

主要试剂：miR-146a(武汉博欧特生物科技有限公司)；流式细胞仪购自(上海然哲仪器设备有限公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂(艾美捷科技有限公司)；L型钙通道蛋白(CaV1.2)抗体(武汉益普生物科技有限公司，货号：ATA25947)；CaV1.3抗体(上海恪敏生物科技有限公司，货号：bs-3932R)；Toll样受体(TLR)4抗体(武汉菲恩生物科技有限公司，货号：FNab09837)；髓样分化因子(MyD88)抗体(苏州阿尔法生物实验器材有限公司，货号：BD-PT2928)；核转录因子(NF)-κB抗体(上海西格生物科技有限公司，货号：XG-K97299)。

1.2方法

1.2.1慢病毒载体构建 miR-146a表达下调的慢病毒载体构建、大鼠miR-146a序列查找及设计由上海GeneChem公司完成，重组miR-146a上调病毒载体(Lentiviral-mediated-Rbfox1)、miR-146a下调载体(Lentiviral-mediated-Rbfox1-RNAi)由上海GeneChem公司合成，并经测序验证，病毒滴度为108 TU/ml，制备完成将重组慢病毒载体在-80℃保存。

1.2.2分组及建模 大鼠平均分为4组，其中3组参照郑文婧等〔5〕的方法造模:36只大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，沿颈部正中间切开，将右颈总动脉分离固定在5 ml注射器针头上，采用尼龙线将颈总动脉扎紧，然后将针头抽出，在血流恢复以后将肌肉、皮肤缝合，大鼠喂养6 w后，经血管超声检查，手术侧右颈总动脉舒张末血流速度60～100 cm/s、峰值血流速度155～170 cm/s说明造模成功。造模成功的3组为模型组、过表达组及沉默组，剩余1组为空白组不做特殊处理。

1.2.3慢病毒转染 在建模成功后过表达组、沉默组大鼠右侧颈动脉注射分别含10 μl Lentiviral-mediated-Rbfox1、Lentiviral-mediated-Rbfox1-RNAi的 miR-146a mimic慢病毒悬液。空白组、模型组大鼠注射等量生理盐水。1 w后观察变化。

1.2.4miR-146a基因表达量 采集所有大鼠心室血液，2 000 r/min 4℃离心10 min,收集血清。miRNA采用mirVana PARIS试剂盒提取纯化。在室温下加入取出的500 μl血清样品等体积变性液,混合均匀，加入同样多的体积酸性酚氯仿,摇晃30～60 s；离心5 min，14 000 r/min在室温下操作。把上清液放到另一个管中，加入1.25倍无水乙醇充分混匀，然后加入柱中，离心30 s，12 000 r/min,弃滤液；700 μl加入柱中，清洗1次,12 000 r/min离心30 s，弃滤液；把500 μl加入柱中，清洗2次,12 000 r/min离心1 min；95℃预热洗脱液60 μl加入柱子中，离心1 min 12 000 r/min,收集miRNA。miR-146a上游引物:5′-GGGTGAGAACTGAATTCCA-3′,下游:5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。U6上游引物:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAA-3′,下游:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。实时荧光定量-聚合酶链反应(PCR)提取DNA 0.5 ml血清加等量的裂解液于尖底离心管中，37℃孵育1 h，加入0.1 ml样品稀释液。PCR扩增取上述0.02 ml DNA提取液加入分装好的反应液管中。

1.2.5病理组织学观察 各组大鼠右侧颈动脉注射3.0% 80 mg/kg的戊巴比妥麻醉，迅速取分离鼠右侧颈动脉组织，然后将右侧颈动脉组织制作成标本，用4%多聚甲醛固定，室温下用15%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙、脱水后用石蜡进行包埋，作3 μm的切片，最后苏木素-伊红(HE)染色处理，采用光学显微镜观察大鼠右侧颈动脉病理变化。

1.2.6N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA)、同型半胱氨酸(Hcy)水平检测 采用流式细胞仪分别检测NMDA、Hcy，进行离心处理(转速为3 000 r/min,离心5 min)，弃上清，加入100 μl FACS缓冲液，再加入Fc受体抗体0.5 mg/ml，细胞浸泡3 min。加入荧光抗体1 μl(0.5 mg/ml)，水浴30 min。加入350 μl FACS缓冲液,3 000 r/min，轻轻混匀，离心5 min,弃上清，重复2次，洗细胞去除游离的荧光抗体。取100 μl仪器缓冲液加入去除有利细胞的荧光抗体沉淀细胞后，将悬浮细胞移入FACS专用管中进行检测分析。

1.2.7血管平滑肌细胞的分离培养 将大鼠处死，分离，取双侧骼动脉分权以上2 cm处动脉,刮取血管中膜，然后将血管中膜放置培养皿，剪碎，然后放入含20%胎牛血清的DMEM培养液中培养，5 d换1次液,然后进行检测。

1.2.8血管平滑肌细胞增殖水平 采用MTT比色法检测，将血管平滑肌细胞制成单细胞悬液,然后接种4×103个细胞在96孔板中，将20 μl MTT试剂加入后，培养4 h，弃上清，加入150 μl二甲亚矾，摇晃10 min，490 nm波长处的各孔光密度值使用酶标仪查看。

1.2.9血管平滑肌细胞迁移能力检测 采用细胞划痕实验检测各组血管平滑肌细胞迁移能力，将细胞接种于18孔板中，细胞增长至90%左右时，采用100 μl枪头垂直划3条直线，使用磷酸盐缓冲液(PBS)反复清洗3次，每次清洗3 min，加入0.5%血清培养基并观察24 h，使用倒置显微镜观察各组血管平滑肌细胞迁移能力。

1.2.10CaV1.2、CaV1.3、TLR4、MyD88、NF-κB蛋白 采用Western印迹法检测，取大鼠牙髓组织蛋白。煮沸5 min使蛋白变性后用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后依据蛋白分子大小把凝胶切开并转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用Western封闭液把CaV1.2、CaV1.3、TLR4、MyD88、NF-κB和内参U6蛋白封闭90 min在室内,按1∶1 000加到CaV1.2抗体、CaV1.3抗体、TLR4抗体、MyD88抗体、NF-κB抗体，以1∶2 000加入c-fos抗体,孵育过夜4℃，每隔10 min使用洗涤液清洗1次，共5次。按1∶5 000加入稀释山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G,孵育60 min室温水平摇匀,每隔10 min使用洗涤液清洗1次，共5次。二氨基联苯胺(DAB)显色，定量分析蛋白表达。

1.3统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行F检验、独立样本t检验。

2 结 果

2.1各组miR-146a基因表达量比较 如表1所示，相比于空白组，模型组、过表达组、沉默组miR-146a基因表达量显著较高(P<0.05)；相比于模型组，过表达组miR-146a基因表达量显著较高(P<0.05)；沉默组miR-146a基因表达量显著较低(P<0.05)；相比于过表达组，沉默组miR-146a基因表达量显著较低(P<0.05)。

2.2各组右侧颈动脉组织病理组织学观察 如图1所示，空白组内膜光滑，无增厚现象的出现；模型组血管内膜明显增厚，管腔内已出现狭窄现象；过表达组血管内膜增厚现象严重，管腔血管严重狭窄现象严重，黏膜层增生；沉默组内膜明显光滑，且几乎无增厚现象。

2.3各组血管平滑肌细胞活中CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy表达情况 如表1所示，相比于空白组，模型组、过表达组、沉默组CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy表达显著更低(P<0.05)；相比于模型组，过表达组CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy表达显著更低，沉默组CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy表达显著较高(P<0.05)；相比于过表达组，沉默组CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy表达显著较高(P<0.05)。

表1 各组血管平滑肌细胞活中CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy表达对比

图1 各组右侧颈动脉组织病理观察(HE染色，×400)

2.4各组血管平滑肌细胞增殖、迁移情况比较 如表2所示，相比于空白组，模型组、过表达组、沉默组增殖显著较高，迁移显著较低(P<0.05)；相比于模型组，过表达组增殖显著较高，迁移显著较低；沉默组增殖较低，迁移较高，差异有统计学意义(P<0.05)；相比于过表达组，沉默组增殖较低，迁移较高，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组血管平滑肌细胞增殖、迁移情况比较

2.5各组右侧颈动脉组织TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白表达量比较 如表3、图2所示，模型组、过表达组、沉默组TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白表达量明显高于空白组，差异具有统计学意义(P<0.05)；过表达组TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白表达量明显高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)；沉默组TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白表达量明显低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)；沉默组TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白表达量明显低于过表达组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组右侧颈动脉组织TLR4/MyD88/NF-κB信号 通路蛋白表达量比较

1～4：空白组，模型组，过表达组，沉默组图2 各组细胞TLR4/MyD88/NF-κB信号通路 蛋白表达

3 讨 论

脑卒中目前是死亡率及致残率最高的疾病之一〔6〕。颈动脉狭窄可以分为有症状性狭窄和无症状狭窄，颈动脉狭窄的并发症主要是和大脑供血减少、斑块破裂、血液阻滞相关，大脑出现缺氧缺血时就会发生眩晕、头晕、短暂性失眠及头晕的症状〔7〕。当斑块破裂之后小血块就会随着血流入到大脑中，从而阻塞小动脉血管。血管平滑肌细胞主要分布在人体内脏器官内，平滑肌由中间丝、密体、密斑组成,是构成血管中膜的物质，有着很强的生理功能，可以调节血管的舒张性并维持血管壁的完整性〔8，9〕。平滑肌虽然有类似于肌丝的结构，但是不会像骨骼肌一样有序的排列。平滑肌细胞中的细肌丝有同骨骼肌类似的分子结构，横桥的激活开始于它的磷酸化〔10，11〕。平滑肌大都具有自律性，在遇到牵拉时可作为一个整体起反应〔12〕。血管平滑肌细胞可参与动脉狭窄的疾病进展，增强血管平滑肌的细胞活性可以调节血管的舒张性并维持血管壁的完整性，减少张力，进而造成组织器官出现变形。

miRNA是一类由内源基因编码的单链RNA分子，可以在动植物中参与转录后的基因表达进行调控，存在形式是基因簇、多拷贝、单拷贝，同时也是一类长度为20～24个核苷酸及内生的小RNA〔13〕。miRNA 与其靶基因的进化有着密切的联系，有助于进一步了解作用及机制，miRNA还存在于多种机制，miRNA与靶基因完全互补结合后功能、方式非常的相似〔14，15〕。作用时与靶基因不完全互补结合，大鼠体内沉默miR-146a时，大鼠体内的蛋白及基因等都有着变化，可以提高大鼠血管平滑肌细胞活性〔16〕，提示miR-146a的表达水平与颈动脉狭窄可能相关，miR-146a水平的上升提示着颈动脉狭窄的发生，在血管平滑肌细胞活性增加时，就会降低miR-146a水平，从而减少颈动脉狭窄所导致的身体损伤。

血管平滑肌细胞活中的CaV1.2、CaV1.3、NMDA、Hcy都可以参与疾病的进展〔17〕。其中Hcy受体可以诱导平滑肌的细胞迁移和增殖，NMDA受体介导了Hcy诱导的血管平滑肌细胞的迁移和增殖，在中枢神经系统作为Hcy结合受体已被广泛的研究，Hcy可以活化神经嵴来源的平滑肌细胞〔18，19〕。通过RNA干扰技术沉默大鼠的平滑肌细胞，能够特异性抑制大鼠血管平滑肌细胞CaV1.2、CaV1.3基因。

TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，TLR4是位于九号染色体的基因，在病原体识别及先天免疫激活中起到很重要的基础性作用，同时也是具有结构及功能上的优势，可以很快识别传染源上表达的病原体相关分子的模式，同时还可作为介导机体免疫力的一种重要细胞因子〔20〕。MyD88处于三号染色体的基因，在适应性免疫应答及先天性中有着重要的关键性作用，有着重要的信号转导作用，可以调节促炎基因的激活。NF-κB是一种蛋白质复合物，可以控制转录的DNA，还可以促使细胞存活及细胞因子产生，在所有的动物模型中可以参与细胞的刺激反应，NF-κB也与记忆过程、突触可塑性有关〔21〕。以上论述说明了抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的信号转导，可以很好地抑制颈动脉狭窄大鼠的炎症反应，从而很好的保护颈动脉出现狭窄的发生。

综上所述，沉默miR-146a对颈动脉狭窄模型大鼠血管平滑肌细胞活性有着干预的作用，其作用机制可能与TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关。