苗药吉祥草含药血清对气道平滑肌细胞增殖及IL-1β/COX-2信号通路的作用机制

刘炜 李江 李同瑶 谢友良

(1贵州中医药大学第二附属医院，贵州 贵阳 550002；2贵州中医药大学)

炎症因子、氧化应激和多条信号通路等因素均会引发慢性阻塞性肺关病(COPD)〔1～3〕气道的黏液高分泌，其中白细胞介素(IL)-1β/环氧合酶(COX)-2信号通路是参加气道黏液高分泌信号通路之一，但目前对此通路的研究还较少〔4〕。IL-1β和COX-2介导多种炎症反应，让腺体的分泌物大量增加，进而导致气道黏液长时间处于高分泌状态〔5〕。IL-1β是最早参与炎症反应的炎症因子，当其被多种因素激活时会增加IL-1β活性，导致过多的分泌炎症因子，促进COX-2的表达，COX-2高表达会增加前列腺素类产物的合成，增加血管通透性和支气管黏膜的水肿程度，大量腺体的分泌，过多的渗出物会阻塞气道增加气流阻塞，从而导致气道黏液髙分泌〔6，7〕。吉祥草又叫观音草，是多年生草本植物中的一种，在中国和日本广泛生长，喜好山坡、山谷和密林下，一年四季均可采收，药记载显示苗药吉祥草一般可新鲜使用或晒干使用〔8〕。药物研究发现吉祥草对止咳、平喘、祛风、镇痛等有一定的功效，在苗族当地常被用于治疗咳嗽、支气管炎等〔9〕。研究发现吉祥草对COPD气道黏液高分泌可进行很好的治疗，对患者痰液的分泌量能明显减少〔10〕，但其对气道平滑肌细胞(ASMCs)的影响尚不明确，本文对ASMCs给予苗药吉祥草血清干预，观察其对细胞的增殖及IL-1β/COX-2信号通路的影响。

1 材料和方法

1.1实验动物 20只SD大鼠，清洁级，体质量220～250 g，合格证号：SCXK(贵)2015-0005，购自上海福莱生物科技有限公司；成年6～8周龄BALB/c小鼠(雌性)，购自遵义医学院，合格证号：SCXK(黔)2018-0002。在安静、适当室温、避光的环境下自由摄食饮水。动物实验经贵州中医药大学动物伦理委员会批准进行，实验动物符合伦理委员会规定，伦理委员会编号：hyykll2017038。

1.2试剂与仪器 贵州中医学院第二附属医院住院中药房生产的苗药吉祥草(临床常用剂量30 g，用水煎服成300 ml)；美国Proteintech公司生产的IL-1β抗体和COX-2抗体；杭州碧云天生物技术研究所生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒；Elabscience公司生产的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒；日本Olympus公司生产的IX71型相差显微镜；湖南湘仪实验室仪器开发有限公司生产的L400离心机；日本Nikon公司生产的DXM1200C型数码相机。

1.3含药血清的制备 将20只SD大鼠分为空白组和药物组，每组10只。空白组每次给予1 ml生理盐水灌胃，3次d；药物组给予苗药吉祥草灌胃，给药剂量按照动物实验与人体标准体质量计算公式计算，连续用药7 d；给药后均禁食8 h，第8天末次给药1 h后腹腔注射10%水合氯醛麻醉各组大鼠，取腹主动脉血于离心管中，3 000 r/min离心15 min，0.22 μm微孔滤膜过滤，分装于离心管中，56℃水浴30 min灭活补体，-20℃保存备用。

1.4ASMCs的分离、培养和鉴定 ASMCs的培养采用组织块贴壁法。处死BALB/c小鼠，将小鼠的气管和支气管分离，用Hank平衡盐溶液浸泡气管和支气管。将气管的外膜分离干净，刮除内皮，将其剪成1 mm3小块后置于牛血清中，将青霉素和链霉素均加入到培养基中。当组织块周围的细胞生长融合至80%时，对ASMCs进行鉴定。传代ASMCs后，取4～6代细胞用于实验。

1.5细胞培养和分组 取第四代对数生长的ASMCs，胰酶消化细胞后接种于培养板中，将培养板置于常规培养箱(37℃、5%CO2)培养。待细胞融合度为70%～80%时，更换新的培养基再培养24 h。将细胞分为空白组：正常细胞在150 μl 10%大鼠空白血清培养基+13.5 ml无血清培养基中培养；高剂量组：正常细胞在含150 μl 10%大鼠苗药吉祥草含药血清培养基中培养；中剂量组：正常细胞在含75 μl 5%大鼠苗药吉祥草含药血清+75 μl 5%大鼠空白血清培养基中培养；低剂量组：正常细胞在含75 μl 2.5%大鼠苗药吉祥草含药血清+75 μl 7.5%大鼠空白血清培养基中培养。

1.6CCK-8检测ASMCs增殖 将AMSCs细胞接种于96孔培养板中，滴加细胞悬液后加入每组相应的药物。将孔板置入培养箱中培养，培养条件：5% CO2、37℃，将细胞分别孵育24 h、48 h和72 h。在96孔板的空版内加入CCK-8溶液，继续培养细胞4 h。测定每孔在450 nm处的OD值。

1.7流式细胞仪检测ASMCs凋亡 稀释结合缓冲液为1×结合缓冲液，配制膜联蛋白(Annexin)V/碘化丙啶(PI)染色工作液。将培养板中的培养基弃掉，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤培养板中细胞，弃掉PBS中胰酶消化细胞并孵育，显微镜下观察细胞，当出现胞质回缩、细胞间不相互链接时，将胰酶弃掉，PBS吹打细胞制成悬液，置于流式管中，离心后弃上清液，用Annexin V/PI 染色工作液重悬细胞，吹打细胞后孵育，15 min后用流式细胞仪检测细胞。

1.8ELISA检测细胞培养上清液中IL-1β和COX-2含量 操作按照试剂盒说明书进行。

1.9Western印迹检测细胞中IL-1β和COX-2蛋白表达 取3组细胞加入细胞蛋白裂解液0.5 ml均浆，在4℃环境下离心15 min，取上清液测量蛋白浓度；将蛋白煮沸5 min至变性，经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在5%脱脂奶粉PBST溶液室温下封闭1 h，加入IL-1β、COX-2和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体；抗体在4℃的环境中孵育过夜，洗膜后加入二抗，在37℃的环境中孵育1 h，暗室发光。

1.10统计学处理 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1ASMCs的鉴定 从BALB/c小鼠中分离并培养的AMSCs细胞具有典型的“峰谷”生长状态。染色后发现AMSCs大部分呈阳性，可见所分离出的细胞即为ASMCs。见图1。

2.2各组ASMCs增殖比较 和空白组相比，低剂量组、中剂量组和高剂量组细胞在48和72 h时ASMCs细胞增殖明显降低，且呈逐渐递减趋势，低剂量组细胞增殖率及中剂量组细胞增殖率明显低于高剂量组细胞增殖率(均P<0.05)。见表1。

2.3各组ASMCs凋亡比较 和空白组相比，低剂量组、中剂量组和高剂量组ASMCs凋亡率显著增加，呈逐渐递增趋势，其中高剂量组ASMCs凋亡率显著高于低剂量组及中剂量组(P<0.05)。见表1、图2。

表1 各组细胞增殖、细胞凋亡率及细胞培养上清液中IL-1β和COX-2含量比较

图2 流式细胞仪检测ASMCs凋亡

2.4各组细胞上清液中IL-1β和COX-2含量及细胞中IL-1β和COX-2蛋白表达 和空白组相比，低、中、高剂量组细胞上清液中IL-1β和COX-2含量及ASMCs中IL-1β和COX-2蛋白表达明显降低，且呈逐渐递减趋势，高剂量组细胞上清液中IL-1β和COX-2含量及ASMCs中IL-1β和COX-2蛋白表明显低于低剂量组及中剂量组(P<0.05)。见表1、表2、图3。

表2 各组细胞中IL-1β和COX-2蛋白表达比较

图3 各组ASMCs中IL-1β和COX-2蛋白表达

3 讨 论

中医认为COPD属于“咳嗽”等范围，主要发病原因是肺、肾虚所致，主要病理特征为咳痰浑浊、有淤血等〔11〕；西医认为COPD主要是由持续性的气流受限所致，多种因素均可导致COPD的发生，其中IL-1β/COX-2信号通路在近些年研究较广。促炎因子IL-1β是早期炎症反应中重要的炎症介质之一，可向气道聚集炎症细胞，且在炎症细胞活化中占主导作用，在体内可和多种炎症因子相互作用，加重COPD炎症反应，进而加重肺组织和气道结构的病理损伤〔12〕。IL-1β的分泌由炎症刺激所产生，进而增加COX-2的活性，支气管黏膜发生严重水肿，让腺体的分泌大量增多，进而发生气道堵塞〔13〕。当AMSCs表型转化出现异常时，气道的炎症反应和高反应性也随之增加，对气道的重塑造成严重的影响。AMSCs的增殖、上皮细胞纤维化及血管生成等均是气道重塑主要的组织学特征，其中细胞的增殖尤为重要。当机体受到慢性炎症刺激时会增殖AMSCs的数量，细胞外基质中胶原组织沉积、肌膜增厚，进而导致气道结构发生不可逆的改变〔14〕。目前我省对苗药的研究较少，特别是苗药的炮制研究和技术滞后对苗药的发展造成了严重的影响〔15，16〕。

本研究发现，苗药吉祥草血清对ASMCs的增殖有明显的抑制作用。目前吉祥草在药理作用方面的研究较少，现有研究报道主要集中在抗肿瘤作用上，其已被证实具有抗肿瘤、止咳、化痰、抗炎等作用。杨建琼等〔17〕人建立体外抗肿瘤实验模型，以人肺癌A549细胞为对象，研究吉祥草提取物，发现吉祥草萃取物能抑制A549细胞增殖并诱导细胞凋亡，显示吉祥草具有抗肿瘤活性。

IL-1β是一种重要的炎症介质，有多种细胞因子分泌，例如上皮细胞、巨噬细胞等〔18〕。在机体遭受到感染、损害、生理应激等时，多种细胞均会大量分泌IL-1β，其广泛的生物活性会对多种炎症和趋化因子进行诱导。研究发现在COPD气道炎症中IL-1β时重要的细胞因子，肺部慢性炎症的发生会随着IL-1β的增加而增加。COX-2是COX中一种诱导酶，在细胞受到各种因素刺激时迅速合成。多种物理因素及致病因素会导致气道内炎症反应增加，增加的炎症细胞会促进COX-2的分泌。当IL-1β与某些受体结合后引起COX-2活性增强，进而影响气道的通气功能。本研究发现，苗药吉祥草血清可降低ASMCs IL-1β和COX-2表达，进而降低肺部炎症，改善COPD。骆彩虹等〔19〕通过对COPD患者研究发现，患者在治疗后血清中IL-1β，COX-2和PGE2含量明显降低，苗药吉祥草可有效抑制血清中IL-1β，COX-2和PGE2水平。陈剑波等〔20〕研究发现，制备小鼠COPD模型后，吉祥草对COPD小鼠的症状有明显的改善，其可能通过对炎症因子表达进行抑制，进而对COPD肺脏病理损害进行修复。

综上所述，苗药吉祥草血清可抑制气道平滑肌细胞增殖，促进其凋亡；对细胞中炎性因子IL-1β和COX-2表达也能进行有效的抑制。本实验研究存在一定的不足，仅对细胞中两种炎症因子进行了研究，还不够全面，今后应对多种不同的炎性因子进行研究，为苗药吉祥草治疗COPD提供理论支持。