右美托咪定对脑出血患者神经细胞保护及氧化应激反应的影响

赵世军 李银宏 刘磊 霍保善

(1青海大学附属医院麻醉科，青海 西宁 810001；2佛山市第二人民医院重症医学科)

脑出血是神经外科的常见病，急性期进行血肿清除术有重要意义，但是血肿清除后可继发再灌注的损伤，同时由于残留血肿对细胞的毒性作用及机体强烈的应激性因素均可以引起继发性神经细胞损伤〔1〕。右美托咪定(DEX)是近年应用于临床的新型高选择性α2肾上腺素能受体激动剂，具有镇静、镇痛及抗交感等作用〔2〕。近年发现右美托咪定在麻醉诱导期应用，对术中血流动力学平衡有一定的调控作用，对术后神经系统的功能恢复有一定价值〔3〕。基于此本研究应用前瞻性研究，构建神经细胞的损伤模型，同时收集脑出血手术患者，应用右美托咪定进行干预，观察其对神经细胞保护因子及氧化应激指标的影响，探讨其意义。

1 材料与方法

1.1细胞培养 人神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)购自中国科学院细胞库。培养方法：置于37℃、95%浓度的O2、5%浓度的CO2培养箱中孵育，应用的培养液为含90%的DMEM、10%的胎牛血清及100 U/ml的青霉素和100 mg/ml链霉素，细胞均呈贴壁生长状态。实验前接种，密度为5 000个/cm2。建立对照组(C组)、实验组(FeCl2组)和右美托咪定组(FeCl2+DEX组)。参照预实验及相关文献选择100 μmol/L的FeCl2的浓度构建损伤的细胞模型〔1〕。DEX选择20 μmol/L最理想的浓度。

1.2临床资料及麻醉方法 选择2018年5月至2019年6月确诊为脑出血并行手术治疗的76例患者，按入院顺序进行编号，随机分为观察组和对照组各38例。纳入标准：①脑出血急性期行全麻下血肿清除术；②美国麻醉医师协会(ASA)≤Ⅳ级，Glasgow评分≥5分。排除标准：①伴有其他器官严重内科疾病者；②有精神疾病史；③合并蛛网膜下腔出血者。剔除标准：①术中出血量超过1 500 ml；②术后出血行二次手术者。患者或家属均签署知情同意书，研究经医院伦理委员会批准。

麻醉方法：患者入室后行气管插管，观察生命体征平稳后，观察组应用0.5 μg/(kg·h)持续输注DEX至术毕，对照组输注等量生理盐水。面罩预充氧3 min后，丙泊酚TCI初始靶浓度3 μg/ml，待效应室浓度平衡。静脉注射苯磺酸顺式阿曲库铵，靶控输注瑞芬太尼后，经口插入气管导管，调节通气，监测血氧及中心静脉压。调节麻醉药的血浆靶浓度，持续泵注顺式阿曲库铵至术毕，关闭硬脑膜前静注芬太尼20 μg，术毕前30 min静注氟比洛芬酯，术后注意镇痛，并应用托烷司琼。积极处理不良反应及并发症。

1.3方法

1.3.1CCK-8法检测细胞活力 取对数生长期细胞接种在96孔板中，孵育过夜，每孔加100 μl培养液和10 μl CCK8试剂，避光孵育2 h，用酶标仪在波长450 nm处测定吸光度(A)值，细胞活力计算公式：细胞活力(%)=(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)×100%。

1.3.2miR-146a表达的检测 应用实时荧光定量PCR(qPCR)法检测miR-146a的表达。引物上游：5＇-GGGATGCGTGCGATTCCA-3＇，下游：5＇-CATGTGCGTCACGTGGATG-3＇，产物为98 bp。U6为内参，上游：5＇-GCATAACACTAGAGGGTCCA-3＇，下游：5＇-CAGGTGAATTTCCCAGGTCGG-3＇，产物为75 bp。应用TRIzol提取总RNA。cDNAs由TaqMan MicroRNA反转录试剂盒合成。反应程序：95℃ 10 min，循环1次；95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，循环35次，72℃延伸7 min。60℃采集信号。记录Ct值，通过2-ΔΔCt法计算目的基因和相对表达水平。

1.3.3细胞系中BDNF、S100B和PCNA的检测 内参应用GAPDH。BDNF、S100B和PCNA的试剂武汉博士德生物技术公司。制备分离胶后加样，应用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转膜、洗膜、封闭，依次滴加一抗、二抗，显影。行灰度分析，应用Image J完成，以蛋白与GAPDH的比值的半定量结果进行分析。

1.3.4血清中BDNF、S100B、超氧化物歧化酶(SOD)和miR-146a的检测 检测术前、术中、术毕、术后第1、2、3天患者血清中BDNF、S100B、SOD和miR-146a的表达。试剂盒均购自苏州睿赢生物技术公司。BDNF、S100B的检测应用酶联免疫吸附试验(ELISA)。SOD的检测应用黄嘌呤氧化酶法。MiR-146a的检测应用qPCR法。

1.4统计学方法 采用SPSS17.0软件进行χ2检验、t检验。

2 结 果

2.1各组细胞系中细胞活力的比较 利用CCK-8试剂盒，检测0～5 d细胞的活力。从第2天开始，FeCl2组细胞活性明显低于C组，此种改变持续至第5天。而FeCl2+DEX组细胞活性明显高于FeCl2组(P<0.05)。即DEX能改善细胞的增殖作用。见表1。

表1 各组细胞系中细胞活力的比较(%，n=3)

2.2各组细胞系中miR-146a表达水平的比较 应用qPCR法检测第5天各组细胞中miR-146a表达，结果显示FeCl2组miR-146a表达(0.98±0.09)明显高于C组(0.65±0.08,P<0.05)，FeCl2+DEX组miR-146a表达(0.86±0.08)明显低于FeCl2组(P<0.05)。即DEX能下调miR-146a的表达。

2.3各组细胞系中BDNF、S100B和PCNA表达的比较 应用Western印迹检测第5天各组细胞系中BDNF、S100B和PCNA表达，结果显示FeCl2组BDNF和PCNA表达明显低于C组，S100B表达明显高于C组，而FeCl2+DEX组BDNF和PCNA表达明显高于FeCl2组，S100B表达明显低于FeCl2组(P<0.05)。即DEX能上调BDNF和PCNA的表达，下调S100B的表达。见图1、表2。

图1 各组细胞系中BDNF、S100B和PCNA表达的比较

表2 各组细胞系中BDNF、S100B和 PCNA表达比较

2.4脑出血患者基线资料 观察组共38例患者，1例术中出血量超过1 500 ml提前终止干预；对照组共38例患者，1例术后颅内出血行二次手术。均排除观察。两组各37例完成观察及检测。观察组中男21例，女16例；年龄34～84岁，平均(59.6±7.5)岁；身高146～189 cm，平均(169.1±22.6)cm；体重40～102 kg，平均(69.7±19.7)kg。对照组中男19例，女18例；年龄35～83岁，平均(58.9±12.6)岁；身高149～187 cm，平均(168.9±32.1)cm；体重42～99 kg，平均(65.6±18.3)kg。两组一般资料无明显差异(P>0.05)。

2.5两组谵妄发生率比较 术后第1、2天及术后3 d内观察组谵妄发生率明显低于对照组(P<0.05,P<0.01)。见表3。

表3 两组谵妄发生率比较〔n(%),n=37〕

2.6两组各时点 BDNF、S100B、SOD和miR-146a表达比较 两组术前血清中BDNF、S100B、SOD和miR-146a表达无统计学意义；观察组术中、术毕、术后第1、2天时BDNF、S100B、SOD和miR-146a表达与对照组比较有统计学差异(P<0.05)。见表4。

表4 两组各时点BDNF、S100B、SOD和miR-146a表达比较

3 讨 论

脑出血急性期神经细胞伴有直接损伤和间接损伤。间接损伤主要为损伤因子诱发的。本实验选择SH-SY5Y细胞，构建神经细胞损伤的细胞模型，由于FeCl2对神经细胞的毒性作用强〔4〕，且受损的神经细胞与出血后的神经细胞功能相似(均为铁过载状态)，因此选择FeCl2为损伤因子〔5〕。实验发现FeCl2和DEX组的细胞活性明显增强，且趋于正常细胞的活性，提示DEX能改善损伤神经细胞的增殖能力，提高修复功能〔6〕，此种作用经PCNA表达的实验证实。有研究认为DEX可以减少由Caspase-3介导的细胞凋亡，使细胞损伤的内质网因素也起到了不同程度的抑制〔7〕。BDNF是神经细胞保护因子，本研究提示DEX对神经细胞的保护作用可能是通过介导BDNF上调实现的。研究显示DEX调控时可引起下游核因子κB的活化，调节凋亡和炎症反应〔8，9〕。这个作用可能也是DEX对神经细胞保护的重要途径之一。S100B是本实验选择的神经细胞损伤因子，是胶质细胞的钙结合蛋白，其在神经细胞损伤后在神经细胞、神经细胞周围及血清中均能检测到其表达升高，这与神经细胞的降解相关，也与神经细胞的损伤后周围炎性因子的刺激相关。S100B激活后氧自由基产生增多、兴奋性氨基酸释放过量、细胞内钙超载、线粒体损伤、凋亡基因激活、炎症反应及免疫应答等均可以加重脑损伤。本实验显示，DEX能使损伤的神经细胞中S100B的表达下调，抑制神经细胞周围的液体环境，对正常内环境细胞因子网络平衡的恢复有重要价值。MiR-146a和SOD是氧化应激指标，SOD是保护因子，有研究显示SOD可能是miR-146a的下游靶基因，二者可共同调控局部的应激性反应〔10〕。本研究证实了DEX对miR-146a的下调作用及对SOD的上调作用，使神经细胞损伤程度减弱，应激反应减弱〔11，12〕。也有研究显示，氧化应激反应与局部神经细胞损伤后铁蛋白增高有关〔13，14〕。本研究虽然未显示出二者靶的靶向关系，但是DEX对二者均有调控也间接证实了二者的协同性。DEX使机体的氧化应激反应控制在一定的水平。本实验细胞系干预中DEX对miR-146a进行调控，但是对细胞内的铁无明显作用，使本研究结果更客观。

本实验表明，脑出血患者术中应用DEX可以减少应激反应，提高血清中神经细胞保护因子的表达。DEX可以引起术后患者谵妄发生率明显下降，这与DEX应用后减轻脑水肿，改善神经系统评分，抑制炎症反应均有关。DEX在术中应用是安全的，也有研究显示DEX可以抑制炎症因子的升高〔15，16〕。DEX应用后血清中BDNF、S100B、SOD和miR-146a的表达有趋势性改变，这与细胞系实验中的结果较为一致。DEX的药理作用是抑制蓝斑核去甲肾上腺素释放和神经元细胞膜的超级化，通过抑制腺苷酸环化酶的活性减少环磷酸腺苷(cAMP)的生成〔17，18〕。DEX的药理作用是改善不完全损伤神经细胞的形态，通过ERK通路刺激星形胶质细胞产生BDNF，降低S100B蛋白的表达，同时对应激反应进行调控，改善机体内环境中细胞因子网络的平衡〔19，20〕。DEX减弱患者术中和术后的应激损伤〔21，22〕。这种作用与DEX能降低血浆中儿茶酚胺的浓度、抑制交感神经兴奋可能有关〔23〕。

综上，DEX能发挥脑出血神经细胞的保护功能，降低氧化应激水平。脑出血患者应用DEX后谵妄发生率低，血清学指标趋势于稳定，临床中可以积极应用。