串联质谱技术在河源地区新生儿遗传代谢性疾病筛查中的临床应用价值分析

张 旻，刘晓燕，凌振威，邓顺娣

（河源市妇幼保健院医学遗传科，广东 河源 517000）

遗传代谢疾病是影响新生儿出生质量的一大因素，目前发现的已达1000 多种。该类疾病的主要症状为不明原因抽搐、呕吐、呼吸困难、肝脾肿大、生长迟缓、发育不良和精神行为异常等[1-2]。目前广东河源地区每年仍有罹患遗传代谢疾病的新生儿，因此，有待于临床探索更佳的早期筛查手段和诊疗手段。近几年随着疾病筛查技术的迅速发展，用于遗传代谢疾病筛查的方法也逐渐多样化，其中被逐渐应用于临床遗传病筛查领域的串联质谱技术（MS/MS）受到广泛认可[3]。该技术的原理是通过将检测样本中的物质进行电离，从而形成各种不同质荷比的离子，利用电磁场分离后，对各种物质的峰强度进行精确测量，并通过比较待测物质与标准液来进行定性和定量分析。此技术方法有效做到了同时对一种样本进行多种代谢物检测，经微观分析得到血液中的多种化合物数据，可有效提高检测效率、灵敏度和准确性[4-5]。我院是河源地区首家开展串联质谱技术应用的医疗机构，并且利用其对在我院出生的新生儿进行相关筛查的覆盖率达到了100%。基于此，本文选取河源地区2021 年2月至2021 年8 月出生的3632 例新生儿作为筛查对象，探讨串联质谱技术在广东省河源地区新生儿遗传代谢性疾病筛查中的应用价值，以期将其在临床中推广应用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取河源地区2021 年2 月至2021 年8 月出生的3632 例新生儿作为筛查对象。其中男性与女性的例数分别为1978 例、1654 例，出生时间最短为1d，最长为14d，平均出生时间为（5.2±1.7）d。早产新生儿与足月分娩新生儿的例数分别为203 例（5.59%）、3429 例（94.41%）。正常出生体重儿有3353 例，占总体的92.31% ；巨大儿105 例，占总体的2.89% ；低体重新生儿有174 例，占总体的4.79%。本研究经我院伦理委员会批准，所选取的新生儿家属均知情同意。所纳入的对象均为我院普通体检新生儿，接受新生儿遗传代谢性疾病筛查时新生儿已充分哺乳，哺乳次数在8 次以上。

1.2 研究方法

1.2.1 筛查标本的采集与保存 所用滤纸均为国际通用标准滤纸S＆S903。首先选择新生儿的足跟内侧或外侧位置进行血液采集，采集前需注意酒精消毒，其中第一滴血液需弃用，将第二滴血液滴到检测滤纸上，依次采集血液，待血斑滤纸自然晾干后，放入密封袋中置于4℃冰箱保存，并及时送检。

1.2.2 实验检测 串联质谱检测仪器选用美国SCIEX公司的三重四极杆质谱仪（AB SCIEX API 3200MD），串联质谱测定试剂盒购自华大基因生物科技有限公司，包含了多种稳定同位素标记的氨基酸、酰基肉碱代谢物，用MS/MS 系统进行分析。新生儿滤纸干血片和质控血片经萃取后直接上机测定，用内标的溶剂萃取滤纸干血片中的氨基酸、酰基肉碱代谢物。具体步骤为：1）在新筛信息系统上编辑好实验清单，并打印出来；2）准备标本: 按照实验清单的顺序在滤纸上打下3mm 直径的氨基酸质控、肉碱质控以及标本，并依次放置到96 孔过滤板内；3）提前一天配制内标溶液：一瓶内标粉末加入100 μL 内标溶解液，轻轻摇匀溶解，低温超声处理1.5h，置于4 ～8℃密封、避光环境下保存；4）配制内标工作液：内标溶液使用前用旋涡振荡器混匀，按照内标溶液：萃取液=1:99的比例配制工作液；5）萃取: 在96 孔过滤板内加入100 μL 内标工作液，将过滤板与反应板用橡皮筋绑在一起，封膜静置或用振荡器振荡30min，振荡频率为750 次/min；6）吹干: 反应完成后，用离心机（转速2000 r/min）离心2 min ；将反应板取下，放置在氮气吹扫仪上，设置氮气流速为0.7 ～1.0，主板温度50℃，吹扫时间20 min；7）衍生：在吹干的反应板内加入60 μL 的衍生试剂，贴上封膜，60℃下静置孵育30min，然后取下封膜，将反应板置于氮气吹扫仪上，在50℃氮气流下进行吹干，时间约为20 min；8）复溶：反应板每孔加入100 μL 流动相，用离心机（转速4000 r/min）离心5min 后即可上机检测。

1.2.3 可疑阳性情况处理 当出现可疑阳性情况则需针对性对该例样本进行再次检测，若经过两次复查后仍为阳性，即转入专科进行专项检查。

1.3 观察指标

本研究主要通过串联质谱技术检测新生儿遗传代谢性疾病筛查相关的氨基酸、酰基肉碱代谢产物浓度，根据各种氨基酸、酰基肉碱同位素内标的离子峰强度,由已知浓度的内标, 自动计算出所测样品中氨基酸、酰基肉碱的浓度。分析初筛阳性结果与最后诊断的结果，并综合分析阳性病例的基因检测结果和尿代谢物检测结果。

2 结果

采用串联质谱技术检测的3632 例新生儿中有105 例初筛可疑阳性患儿，其中病情为氨基酸代谢异常的48 例、为酰基肉碱缺陷的57 例。对105 例患儿进行后期回访确诊，其中20 例进行遗传病基因分析，有12 例异常；9 例进行尿液气相色谱质谱分析，有4例异常。因患儿早期得到了持续监测，及时指导喂养与治疗干预，目前并无其他严重影响，最后确诊出苯丙酮尿症1 例，该患儿实验室诊断发现PAH 基因点突变阳性。

2.1 3632 例新生儿实施串联质谱技术筛查结果的分析

在遗传代谢病筛查阳性病例中，发现氨基酸代谢障碍类遗传代谢病48 例，其中高苯丙氨酸血症13 例、甲硫氨酸血症6 例、高甘氨酸血症6 例、酪氨酸血症6 例、Citrin 蛋白缺乏症4 例、多种氨基酸升高4 例、枫糖尿病3 例、组氨酸血症3 例、多种氨基酸降低2 例、苯丙酮尿症1 例。

在遗传代谢病筛查阳性病例中，发现酰基肉碱缺陷类遗传代谢病57 例，其中肉碱棕榈酰转移酶-1 缺乏症35 例、酰基辅酶A 脱氢酶缺乏症11 例、原发性肉碱缺乏症5 例、β- 酮硫解酶缺乏症4 例、肉碱棕榈酰转移酶-2 缺乏症2 例。

2.2 筛查阳性病例进行基因检测和尿代谢物检测结果的分析

在105 例筛查阳性病例中，有20 例新生儿进行基因检测，初步分析结果发现12 例阳性患儿，肝豆状核变性（Het）并Gilbert 综合征/Crigler-Najjar 综合征1 例，Gilbert 综合征/Crigler-Najjar 综合征（Het）4 例，Gilbert 综合征/Crigler-Najjar 综合征（Hom）1例，苯丙酮尿症1 例，丙酮酸羧化酶缺乏症（Het）1 例，常染色体隐性耳聋1A 型并氨基糖苷类药物敏感性耳聋1 例，克拉伯病（Het）1 例，糖原累积病Ⅱ型（Het）1 例，肝豆状核变性（Het）1 例。

对9 例新生儿尿代谢物检测结果进行初步分析发现，其中有4 例阳性患儿，甲基丙二酸、戊二酸略高1 例，轻度酮尿1 例，轻度酮尿伴甘油增高1 例，酮性双羧酸尿伴3 羟基丙酸略高1 例。

2.3 1 例确诊苯丙酮尿症患儿的基因分析

通过对1 例苯丙酮尿症患儿实施基因分析可知，此患儿在PAH 基因2 个位置发生基因突变，都是错义突变，分别是：1）NM_000277.1:c.721C＞T：为错义 (missense) 变异，导致该基因转录本编码的蛋白质中第 241 号氨基酸由精氨酸变为半胱氨酸。该变异在ExAC 东亚人群中发生频率为 0.001278。在 Clinvar 中这个变异为致病变异，对应的疾病为 Phenylketonuria。在 HGMD 专业版中这个变异为致病变异，对应的疾病为 Phenylketonuria。根据 ACMG 指南， 这个变异是致病变异。2）NM_000277.1:c.611A＞G：为错义 (missense)变异，导致该基因转录本编码的蛋白质中第 204 号氨基酸由酪氨酸变为半胱氨酸。该变异在 ExAC 东亚人群中发生频率为 0.000231。在 Clinvar 中这个变异为致病变异，对应的疾病 为 Phenylketonuria。在HGMD 专业版中这个变异为致病变异，对应的疾病为Phenylketonuria。根据 ACMG 指南， 这个变异是致病变异。详见表1。

表1 1 例苯丙酮尿症患儿的基因分析结果

3 讨论

随着医疗科技水平的提升，新生人口素质的提高逐渐成为了预防医学的主要攻关方向[6-7]。相关研究[8]表明，先天性的遗传代谢性疾病在很大程度上导致了新生儿较差的身体素质，严重影响后期发育，需对儿童采取相应筛查工作，以便于在疾病出现前对其作出明确的诊断。因此，对遗传疾病的控制与治疗具有重要意义。串联质谱技术的原理主要是通过对样品中的物质进行质荷比检测，定性和定量分析物质成分和结构，在其临床应用中可实现对液体样本中几十种物质的准确检测，包括脂肪酸、氨基酸、酰基肉碱等常见代谢物，能有效实现快速筛查与诊断30 多种代谢性疾病，有效提高了此类疾病的早期发现率，使疾病筛查从传统模式中的“一种实验检测一种疾病”转变到了“一种实验检测多种疾病”的现代化高效筛查模式，使得临床上对于遗传代谢疾病的筛查与诊断效率得到了显著的提高[9-11]。

本研究的结果显示，河源地区新生儿遗传代谢病筛查的阳性率约为2.89%（105/3632），检出结果为氨基酸代谢障碍类遗传代谢病和酰基肉碱缺陷类遗传代谢病。在遗传代谢病筛查阳性病例中，发现氨基酸代谢障碍类遗传代谢病48 例，酰基肉碱缺陷类遗传代谢病57 例，充分证明了串联质谱技术对于新生儿遗传代谢疾病有较强的检测效果，可为后续疾病确诊提供有效资料。同时，通过对患儿实施进一步确诊，分别发现12 例基因结果异常和4 例尿代谢物结果异常，从侧面反映了质谱检测技术对于遗传代谢疾病的检测效果。

在后期的基因确诊中检出苯丙酮尿症1 例。PAH基因变异与苯丙酮尿症相关，遗传方式为常染色体隐性。这例苯丙酮尿症患儿主要发现2 个有临床意义的基因变异，分别为蛋白质中第241 号及第204 号氨基酸发生变异， PAH 基因双杂合致病的变异增高了新生儿患苯丙酮尿症的风险，在后续检测中，经过此检测结果提示，尽快完善了该患儿的相关临床检查，综合分析了患儿的临床表型从而确诊疾病，明确了串联质谱技术在此类遗传代谢病筛查中的应用价值。目前的研究显示，遗传代谢病具有明显的种族和区域性差异，表现多样且缺乏特异性, 易误诊，常伴高血苯丙氨酸、高尿苯丙酮酸，该病危害较大，会对中枢神经系统造成损害。如果不及时治疗，会导致身体生长发育迟缓，特别是精神发育迟缓。其表现是儿童的智商低于同龄正常儿童，因此该病在本地区遗传代谢病筛查中应加以重视[12-15]。笔者认为，通过串联质谱技术对新生儿进行遗传代谢性疾病筛查，能够在早期及时准确地发现遗传异常情况，为早期发现新生儿遗传代谢性疾病、改善新生儿生存质量和提高人口素质提供可靠保障，并能有效降低先天性疾病对新生儿及其家庭造成的负担。

综上所述，串联质谱技术在新生儿遗传代谢性疾病筛查中具有较高的应用价值，可实现对氨基酸代谢障碍类遗传代谢病和酰基肉碱缺陷类遗传代谢病的精准检测，值得推广应用。