棉花中不同植物病毒介导的VIGE体系的研究

雷建峰 李 月 代培红 赵 燚 尤扬子 贾建国 赵 帅 曲延英,* 刘晓东,*

棉花中不同植物病毒介导的VIGE体系的研究

雷建峰1李 月2代培红2赵 燚2尤扬子2贾建国1赵 帅1曲延英1,*刘晓东2,*

1新疆农业大学农学院 / 教育部棉花工程研究中心, 新疆乌鲁木齐 830052;2新疆农业大学生命科学学院, 新疆乌鲁木齐 830052

植物病毒介导sgRNA的传递与表达相比传统转化完整的编辑载体进行基因编辑具有巨大优势, 因为sgRNA的表达可以伴随着病毒的复制和移动而快速扩增、累积, 从而产生高效的基因编辑效率。为在棉花中开发应用更多植物病毒介导的基因编辑系统(virus-induced genome editing, VIGE)。本研究以超表达Cas9 (Cas9-OE)棉花作为VIGE受体, 在棉花中分别建立了棉花叶皱缩病毒(cotton leaf crumple virus, CLCrV)和烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus, TRV)介导的VIGE系统。首先CLCrV和TRV介导的VIGE均可以靶向敲除棉花和基因A亚组和D亚组基因组序列, 验证了这2个系统的可行性和有效性。进一步量化这2个系统对和基因的编辑效率结果发现, CLCrV和TRV介导的VIGE均能够产生高效的基因编辑效率, 并且2种系统基因编辑效率不存在显著差异。本研究还探究了使用棉花内源U6启动子和拟南芥U6启动子驱动sgRNA对VIGE基因编辑效率的影响。结果显示, 这2个启动子介导的VIGE均能够产生高效的基因编辑效率, 并且基于这2种启动子介导的VIGE系统基因编辑效率不存在显著差异。以上结果预示着可以开发更多的植物病毒载体应用于棉花基因编辑的研究, 进而获得高效的sgRNA筛选体系。

棉花; CLCrV; TRV; VIGE; 基因编辑

棉花基因功能的鉴定和新品种的选育离不开遗传变异突变体的获得, 传统的诱变技术和T-DNA插入等随机突变远远不能满足科学研究和棉花育种的需求。基因组编辑技术是一种强大的技术工具, 它可以利用可编程序列和特异性核酸内切酶(Cas9或Cpf1)在生物体基因组特定位点上产生靶向突变[1-3]。近年来, II型CRISPR/Cas9系统被广泛应用于农作物的基因编辑[4-7]。该系统由single guide RNA (sgRNA)引导核酸内切酶Cas9在非常精确的目标位点上切断双链DNA (dsDNA), 然后生物体通过非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)或同源重组(homologous recombination, HR)进行修复。在缺乏同源DNA模板的情况下, NHEJ途径在修复DSBs过程中可引起目标位点碱基的缺失、插入或替换, 从而在特定位点产生遗传变异[8]。

目前, 棉花基因编辑技术体系已经建立并陆续得到升级和改良(CRISPR/Cpf1和单碱基编辑系统)[9-13]。然而对于遗传转化困难且周期长的棉花而言, 要获得基因编辑的突变体是困难的。即使可以实现遗传转化, 也只是局限于该物种的少数几个基因型。另外, 研究发现作为CRISPR系统关键元件之一的sgRNA, 在很多基因组位点上是低效或者是无效的。而sgRNAs的效率会直接影响到CRISPR/Cas9在棉花中的有效应用。通过生物信息学的方法很难预测sgRNAs的活性[14-15]。因此, 在采用CRISPR系统获得突变体之前, 必须尽量减少使用无效sgRNA的风险, 就需要快速筛选出高效的sgRNA。在棉花中将完整的基因编辑载体进行原生质体转化[16]和农杆菌介导的瞬时转化棉花叶片[17]是2种最常见验证sgRNA活性的方法。然而, 这些方法检测到的突变效率低, 甚至很多时候无法有效验证sgRNA的活性。

近期, 植物病毒诱导的基因编辑(virus-induced genome editing, VIGE)被广泛应用于一些模式植物和农作物基因功能的研究[18-22]。该系统需要一个稳定超表达Cas9 (Cas9-OE)的转基因植株作为VIGE受体, 同时将sgRNA表达元件组装在病毒载体上, 借助病毒可以在植物体内系统侵染、复制、扩散的能力投送sgRNA, 从而高效地实现靶基因的定向编辑。棉花叶皱缩病毒(CLCrV, DNA病毒)和烟草脆裂病毒(TRV, RNA病毒)是2种常用于棉花基因沉默的病毒载体, 可用于沉默棉花内源基因的表达[23-24]。本课题组在前期工作中, 对DNA病毒CLCrV载体进行改造分别在拟南芥和棉花中建立了CLCrV介导的VIGE系统[22,25]。在棉花中, RNA病毒TRV是否也可以作为一个理想的病毒载体用于构建VIGE系统, 能否高效地实现对棉花内源基因的靶向编辑尚缺乏相关研究。与此同时, 在前期的工作中, 本课题组使用截短的拟南芥AtU6-26启动子(330 bp)驱动sgRNA表达, 在棉花中获得了比较理想的基因编辑效率。使用棉花内源U6启动子驱动sgRNA表达能否进一步提升VIGE的基因编辑效率, 相关研究也鲜有报道。因此, 在棉花中建立不同植物病毒介导的VIGE系统和探究不同启动子驱动sgRNA表达对基因编辑效率的影响, 对筛选出高效的VIGE体系具有重要意义。

本研究基于DNA病毒CLCrV和RNA病毒TRV载体, 构建了相应的VIGE体系。采用农杆菌注射法将不同sgRNA衍生物接种棉花Cas9-OE植株, 验证这2种VIGE系统的有效性和高效性; 与此同时, 探究不同启动子对VIGE基因编辑效率的影响, 以筛选出适用于棉花基因编辑高效的VIGE系统。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用AtU6-26P::sgRNA、GhU6-5P::sgRNA[26]、棉花叶皱缩病毒CLCrV载体、烟草脆裂病毒TRV载体、棉花Cas9超表达(Cas9-OE)植株YZ-1均为新疆农业大学农业生物技术重点实验室保存。各种限制性内切酶购于Thermo公司; T4DNA连接酶、Blunt Zero平端载体、Trans1-T1感受态细胞、琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNA聚合酶、植物基因组DNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒、2K Plus II DNA Marker均购自于北京全式金生物技术有限公司; Phusion超保真DNA聚合酶购自于纽英伦生物技术(北京)有限公司; 其他常规试剂均为国产分析纯; 引物合成及测序均由上海杰李生物技术有限公司完成。

1.2 qRT-PCR分析Cas9表达量

利用Biospin Plant Total RNA提取试剂盒从野生型和Cas9-OE棉花子叶中分离总RNA。然后用反转录试剂盒One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix合成cDNA。通过qRT-PCR扩增188 bp基因片段, 以棉花基因为内参对照(引物设计见表1), 每个样本设置3个技术重复。反应结束后, 根据目的基因和内参基因的Ct值, 利用2–DDCt方法[27]计算基因表达量。

1.3 不同植物病毒介导的VIGE体系的建立

1.3.1 sgRNA中间载体的构建 使用截短的AtU6-26 (330 bp)和GhU6-5P (363 bp)启动子驱动sgRNA表达。文中所提及的和基因的guide RNA (表1)通过退火: 95℃每5 s降低0.5～20.0℃, 插入到经I酶切的AtU6-26::sgRNA和GhU6-5P::sgRNA载体上, 测序验证- sgRNA和-sgRNA表达载体是否正确。

1.3.2 CLCrV-sgRNA和TRV-sgRNA载体构建 用I和I酶切回收AtU6-26::- sgRNA、AtU6-26::-sgRNA、GhU6-5P::-sgRNA和GhU6-5P::-sgRNA片段, 将其分别组装在CLCrV-A上; 同时用I和I酶切回收AtU6-26::-sgRNA、AtU6-26::-sgRNA、GhU6-5P::- sgRNA和GhU6-5P::-sgRNA片段, 将其分别组装在TRV-V2上。CLCrV-sgRNA和TRV-sgRNA载体示意图见图1。采用酶切鉴定的方法验证这些重组质粒是否正确, 将鉴定正确的表达载体转入农杆菌GV3101, 用于下一步侵染。

表1 本研究中使用的引物序列

图1 CLCrV-sgRNA和TRV-sgRNA载体构建

1.4 不同植物病毒投送sgRNA瞬时转化Cas9- OE棉花

Cas9-OE棉花品种YZ-1种子在ddH2O水中浸泡3 d, 然后在黑暗中28℃发芽48 h。发芽后, 将幼苗移栽到土壤中, 在28℃、12 h光照/12 h黑暗条件下生长。待棉花幼苗2片子叶完全展开时进行接种转化试验。将构建好的不同CLCrV-sgRNA和TRV-sgRNA载体的农杆菌菌液接种于2 mL LB培养基(含50 µg mL–1Kan和50 µg mL–1Rif)中活化, 28℃、200转 min-1过夜培养。按1∶100比例分别吸取不同活化菌液接种到15 mL LB培养基(含50 µg mL–1Kan和50 µg mL–1Rif)中, 再次28℃、200转 min-1摇菌, 统一摇至菌液的OD600= 1.6～1.8时, 1000×离心15 min收集农杆菌培养物, 重悬于转化液(10 mmol L–1MgCl2, 10 mmol L–1MES和200 μmol L–1乙酰丁香酮)中, 调整OD600至1.0左右, 在室温下避光孵育3～4 h。接种病毒时, 将CLCrV-B和CLCrV-A的衍生物, TRV-V1和TRV-V2的衍生物1∶1等比例混合, 利用1 mL注射器将转化液注射到Cas9-OE棉花子叶中进行瞬时表达。

1.5 突变检测

sgRNA可伴随着病毒的复制和扩散在棉花体内系统的表达, 接种相应病毒载体的棉花子叶是sgRNA表达的起点。采用Plant Genomic DNA提取试剂盒分别从接种7～10 d后的CLCrV-B和CLCrV-A衍生物, TRV-V1和TRV-V2衍生物的棉花子叶中提取基因组DNA。利用PCR/RE[17]的方法检测和基因目标位点是否发生突变, PCR扩增包含目标位点的基因组片段, 扩增引物见表1。用靶位点的限制性内切酶消化PCR产物。同时, 未被消化的PCR扩增子被克隆到Blunt Zero平端克隆载体上进行测序。

1.6 不同植物病毒介导的VIGE基因编辑效率分析

分别提取每一株接种CLCrV-AtU6-26::- sgRNA、TRV-AtU6-26::-sgRNA、CLCrV- AtU6-26::-sgRNA和CLCrV-AtU6-26::-sgRNA棉花叶片基因组DNA。以每一株转化植株的基因组DNA为模板, 参照和基因组序列进行PCR扩增, 并用靶位点上相应的限制性内切酶消化PCR产物, 检测每个单株CLCrV和TRV介导的VIGE系统对和基因的编辑效率。

1.7 不同U6启动子介导的VIGE基因编辑效率分析

以棉花基因为靶标, 分别提取每一株接种CLCrV-AtU6-26::-sgRNA和CLCrV-GhU6-5P::-sgRNA棉花基因组DNA。以每一株转化植株的基因组DNA为模板进行PCR扩增并用靶位点上的限制性内切酶I消化PCR产物, 检测每个单株在CLCrV介导的VIGE系统下, 使用棉花内源U6启动子和拟南芥U6启动子驱动-sgRNA表达对棉花基因的编辑效率。

2 结果与分析

2.1 棉花Cas9-OE植株Cas9基因表达量检测

以野生型棉花YZ-1和Cas9-OE棉花cDNA为模板, 进行qRT-PCR扩增。成功检测到不同Cas9-OE植株中基因稳定表达(图2)。qRT-PCR验证了在转基因棉花植株中高效表达, 本研究选择了表达量较高的Cas9-OE: 1～6转基因株系用于后续研究。

图2 qRT-PCR分析Cas9表达量

在同一指标中不同小写字母表示不同处理在0.05概率水平差异显著。

Different letters indicate significant difference among different treatments at the 0.05 probability level.

2.2 CLCrV-sgRNA和TRV-sgRNA载体构建

将4个AtU6-26::-sgRNA、AtU6-26::-sgRNA、GhU6-5P::-sgRNA和GhU6-5P::-sgRNA分别与CLCrV-A和TRV-V2片段连接, 对8个重组的质粒进行酶切鉴定:用I和I对CLCrV-AtU6-26::- sgRNA、CLCrV-AtU6-26::-sgRNA重组质粒进行双酶切, 产生了516 bp和11,300 bp 2条带, 对CLCrV-GhU6-5P::-sgRNA、CLCrV-GhU6- 5P::-sgRNA双酶切, 产生了514 bp和11,300 bp 2条带; 用I和I对TRV-AtU6- 26::-sgRNA、TRV-AtU6-26::- sgRNA重组质粒进行双酶切, 产生了516 bp和11,003 bp 2条带, 对TRV-GhU6-5P::- sgRNA、TRV-GhU6-5P::-sgRNA双酶切, 产生了514 bp和11,003 bp 2条带, 所有酶切结果与预期酶切片段大小相符(图3), 表明不同CLCrV-sgRNA和TRV-sgRNA载体均已构建成功。

2.3 CLCrV和TRV介导靶向敲除棉花GhBsrk1和GhMAPKKK2基因

随机选取3～4株接种CLCrV-AtU6-26::- sgRNA、CLCrV-AtU6-26::-sgRNA、TRV-AtU6-26::-sgRNA、TRV-AtU6-26::-sgRNA棉花叶片混样, 提取总DNA。以野生型棉花基因组DNA和混样DNA为模板, 通过PCR/RE的方法验证和基因是否在目标位点发生突变。PCR扩增基因(777 bp), 对I酶切未消化的PCR产物进行克隆测序, 发现所有突变类型都为靶序列区域碱基的缺失或插入(图4-A～C)。PCR扩增基因(607 bp), 对I酶切未消化的PCR产物克隆测序, 发现所有突变类型均为PAM位点上游碱基的缺失(图4-D～F)。而在对照野生型棉花中,和基因的PCR产物被相应的限制性内切酶消化完全, 几乎没有扩增产物残留。表明利用CLCrV和TRV介导的VIGE系统均能够实现对棉花内源基因(A亚组和D亚组)的靶向编辑。

图3 不同CLCrV-sgRNA和TRV-sgRNA表达载体的酶切鉴定

M: 2K Plus II DNA 标准分子量; 1: CLCrV-AtU6-26::- sgRNA; 2: CLCrV-AtU6-26::-sgRNA; 3: CLCrV- GhU6-5P::-sgRNA; 4: CLCrV-GhU6-5P::- sgRNA; 5: TRV-AtU6-26::-sgRNA; 6: TRV-AtU6-26::-sgRNA; 7: TRV-GhU6-5P::G-sgRNA; 8: TRV- GhU6-5P::-sgRNA。

M: 2K Plus II DNA marker; 1: CLCrV-AtU6-26::-sgRNA; 2: CLCrV-AtU6-26::-sgRNA; 3: CLCrV-GhU6-5P::-sgRNA; 4: CLCrV-GhU6-5P::-sgRNA; 5: TRV-AtU6-26::-sgRNA; 6: TRV-AtU6-26::- sgRNA; 7:TRV-GhU6-5P::G-sgRNA; 8:TRV-GhU6-5P::-sgRNA.

(图4)

M: 2K Plus II DNA标准分子量。A和B:-sgRNA靶向突变检测。A: WT为对照, 1和2分别为接种CLCrV-AtU6-26::-sgRNA和TRV-AtU6-26::-sgRNA植株编号, 凝胶电泳图显示基因经I酶切消化的产物和未消化的PCR产物。B: 未消化的PCR产物缺乏I位点(由于存在突变), 随后进行纯化、克隆和测序分析。C:突变测序峰图; D和E:-sgRNA靶向突变检测。D: WT为对照, 1和2分别为接种CLCrV-AtU6-26::-sgRNA和TRV-AtU6-26::-sgRNA植株编号, 凝胶电泳图显示基因经I酶切消化的产物和未消化的PCR产物。E: 未消化的PCR产物缺乏I位点(由于存在突变), 随后进行纯化、克隆和测序分析。F:突变测序峰图。PAM位点为绿色, 蓝色下画线表示靶序列上的酶切位点。‘M’表示突变序列, ‘+’碱基插入用红色大写字母表示, ‘-’碱基缺失用红色线段表示。

M: 2K Plus II DNA marker. A and B: the detection of-sgRNA targeted mutations. A: wild type served as a control, 1 and 2 are plant numbers inoculated with CLCrV-AtU6-26::-sgRNA and TRV-AtU6-26::G-sgRNA respectively. The gel image shows digested PCR products ofgene withI and undigested PCR products. B: the undigested PCR products lacking theI site (due to the presence of a mutation) that were subsequently purified, cloned, and analyzed by sequencing. C:mutation sequencing peak map; D and E: the detection of-sgRNA targeted mutations. D: wild type served as a control, 1 and 2 are plant numbers inoculated with CLCrV-AtU6-26::-sgRNA and TRV-AtU6-26::-sgRNA, respectively. The gel image shows digested PCR products ofgene withI and undigested PCR products. E: the undigested PCR products lacking theI site (due to the presence of a mutation) that were subsequently purified, cloned, and analyzed by sequencing. F:mutation sequencing peak map. Green color indicates the PAM sequence, underline in blue indicates the restriction site on the target sequence. M indicates the mutation sequence, insertions are denoted with red uppercase letters, deletions are shown as red dashes.

2.4 CLCrV和TRV介导的VIGE基因编辑效率分析

为进一步量化CLCrV和TRV介导的VIGE基因编辑效率, 提取每一株接种CLCrV-AtU6-26::-sgRNA (8株)、CLCrV-AtU6-26::- sgRNA (12株)、TRV-AtU6-26::-sgRNA (7株)、TRV-AtU6-26::-sgRNA (13株)载体的棉花基因组DNA。对每个单株进行突变检测, 以野生型为对照。在使用相同启动子(AtU6-26)驱动-sgRNA和-sgRNA表达情况下, PCR/RE检测结果显示: 对于基因, CLCrV介导的VIGE基因编辑效率为100% (12/12), TRV介导的VIGE基因编辑效率为92.31% (12/13); 对于基因, CLCrV介导的VIGE基因编辑效率为75% (6/8), TRV介导的VIGE基因编辑效率为85.71% (6/7) (图5)。表明在棉花中针对同一个基因(或者)进行定向编辑, 利用CLCrV和TRV介导的VIGE系统均能够产生高效的基因编辑效率, 并且2种系统基因编辑效率不存在显著差异。

2.5 不同U6启动子介导的VIGE基因编辑效率分析

为探究使用棉花内源GhU6-5P启动子和拟南芥AtU6-26启动子介导的VIGE系统的基因编辑效率是否存在差异。以基因为靶标, 提取每一株接种CLCrV-AtU6-26::-sgRNA (12株)、CLCrV-GhU6-5P::-sgRNA (11株)载体的棉花基因组DNA。对每个单株进行突变检测, 以野生型为对照。由于CLCrV和TRV介导的VIGE基因编辑效率无明显差异, 本研究在CLCrV介导的VIGE下, 探究不同U6启动子介导的VIGE基因编辑效率。PCR/RE突变检测结果显示: 拟南芥AtU6-26启动子介导的VIGE基因编辑效率为100% (12/12), 而棉花GhU6-5P启动子介导的VIGE基因编辑效率同样为100% (11/11) (图6)。表明在棉花中使用棉花内源U6启动子和拟南芥U6启动子驱动sgRNA表达均能够产生高效的基因编辑效率, 并且基于这2种启动子介导的VIGE基因编辑效率不存在显著差异。这暗示着在同源关系较远的不同物种中, U6启动子是可以替换使用的。

图5 CLCrV和TRV介导的VIGE基因编辑效率比较

M: 2K Plus II DNA标准分子量。A: WT为对照, 1～12为接种CLCrV-AtU6-26::-sgRNA单株编号, 13～25为接种TRV-AtU6-26::-sgRNA单株编号。B: WT为对照, 1～8为接种CLCrV-AtU6-26::-sgRNA单株编号, 9～15为接种TRV-AtU6-26::-sgRNA单株编号。

M: 2K Plus II DNA marker. A: wild type, 1–12 are individual plant numbers inoculated with CLCrV-AtU6-26::-sgRNA, 13–25 are individual plant numbers inoculated with TRV-AtU6-26::-sgRNA. B: wild type, 1–8 are individual plant numbers inoculated with CLCrV-AtU6-26::-sgRNA, 9–15 are individual plant numbers inoculated with TRV-AtU6-26::-sgRNA.

图6 不同U6启动子介导的VIGE基因编辑效率比较

M: 2K Plus II DNA标准分子量。A: WT为对照, 1～12为接种CLCrV-AtU6-26::-sgRNA单株编号。B: WT为对照, 1～11为接种CLCrV-GhU6-5P::-sgRNA单株编号。

M: 2K Plus II DNA marker. A: wild type, 1–12 are individual plant numbers inoculated with CLCrV-AtU6-26::-sgRNA; B: wild type , 1–11 are individual plant numbers inoculated with CLCrV-GhU6-5P::-sgRNA.

3 讨论

棉花全基因组测序已经完成, 然而棉花功能基因的挖掘以及全基因组序列的生物学意义还知之甚少。从根源上解析棉花基因功能, 必需要以棉花基因组变异的突变体材料作为研究基础。对于遗传转化困难且周期长的棉花而言, 获得少数几个基因编辑的棉花是经济可行的, 但要大规模构建棉花基因突变体库和实现全基因组水平上的精准遗传改良是费钱、费时, 不可想象的。鉴于获得稳定遗传棉花突变体的时间和难度, 开发一种快速验证sgRNAs活性, 进而获得高效基因编辑效率的方法至关重要。

利用病毒载体进行基因编辑早已被人们认知, 但是由于病毒庞大基因组的限制, 严重阻碍了利用病毒载体进行基因编辑的研究。对于DNA病毒CLCrV和RNA病毒TRV而言, 研究者对病毒基因组进行改造将其组装在植物表达载体上, 使之成为以农杆菌接种的方式侵染棉花叶片, 相继在陆地棉和海岛棉中建立了病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系[23-24,28]。虽然这2种病毒载体受限于病毒承载力的限制, 不适于表达Cas9蛋白, 但足以表达sgRNA。以Cas9-OE植株作为VIGE受体, 利用病毒载体单独投送sgRNA可避免转化完整编辑载体编辑效率低的弊端。本研究为了扩大这2种病毒载体在棉花中的应用范围, 分别在棉花中建立CLCrV和TRV介导的VIGE系统进行测试。在VIGE体系内, 要想获得高效的基因编辑效率,基因的高表达是首要关键因素。本研究首先检测了棉花Cas9-OE植株中的表达量发现,基因在所有Cas9-OE植株中高效表达(图2), 这为验证VIGE的有效性和高效性提供了良好的开端。利用CLCrV和TRV病毒载体投送-sgRNA和-sgRNA, 突变分析结果显示, 在使用相同启动子(AtU6-26)驱动sgRNA表达的情况下, CLCrV和TRV介导的VIGE均可以实现棉花内源基因(A亚组和D亚组)的靶向编辑, 突变类型主要以碱基的缺失和插入为主(图4),相比以往本实验室通过构建完整的编辑载体转化棉花原生质体获得较低的编辑效率(大多数突变类型为点突变)[16], 这2种VIGE系统大大提高了基因编辑的检出率。为进一步量化CLCrV和TRV介导的VIGE基因编辑效率, 对每一个转化单株进行突变检测, 发现CLCrV和TRV介导的VIGE均能够产生高效的基因编辑效率, 并且2种系统基因编辑效率不存在显著差异(图5)。另外, 作为VIGE系统关键元件之一的sgRNA, 使用棉花内源U6启动子驱动sgRNA表达能否进一步提升VIGE的基因编辑效率？本研究继续探究截短的棉花GhU6-5P (363 bp)和拟南芥AtU6-26 (330 bp)启动子介导的VIGE (CLCrV)对每一个转化单株的基因编辑情况发现, 棉花内源U6启动子和拟南芥U6启动子介导的VIGE均能够产生高效的基因编辑效率, 并且基于这2种启动子介导的VIGE基因编辑效率不存在显著差异(图6)。与此同时, 本研究结果也证明了U6启动子在同源关系较远的不同物种之间是可以替换使用的。在今后的研究中CLCrV和TRV介导的VIGE系统或许还可以借助核糖核酸酶或者tRNA的帮助使用一个U6启动子同时表达多个sgRNAs, 实现多基因编辑。

另外, 本研究还通过Hi-TOM高通量测序检测了部分突变单株的真实编辑效率, 突变效率在15.74%～42.68%之间。推测造成不同植株编辑效率存在差异的因素可能与植株自身基因表达量以及sgRNA伴随着病毒复制、扩散能力有关, sgRNA并不是在所有病毒侵染的组织细胞中都表达产生靶向突变。尽管病毒可以高效投送sgRNAs, 实现靶基因的定向编辑。但该事件只能发生在当代植株体内, 由于植物自身存在某种特殊机制使得病毒难以进入到植物的顶端分生组织(SAM)中[29], 实现植物生殖细胞的编辑, 因此基因编辑无法遗传给后代。近期有研究表明将可移动RNA元件(和tRNA)与sgRNA融合后克隆到TRV病毒载体中, 能够将sgRNA长距离运输至烟草的SAM中, 并以较高的效率产生可遗传的基因编辑[30]。除此之外, 研究还发现不修饰的BSMV病毒传递sgRNA能够直接在超表达Cas9的小麦中获得可遗传的基因编辑[31]。这些研究成果为利用VIGE系统在棉花中实现可遗传的基因编辑后代提供了借鉴, 后期的工作仍需开展突破棉花遗传转化途径限制的研究, 从而获得棉花突变体进行功能验证。

以上结果显示基于CLCrV和TRV介导的VIGE系统在棉花上的成功应用, 预示着通过将更多种病毒作为VIGE载体, 在棉花上进行验证是有可能筛选到适合的VIGE系统的, 这为定向创制棉花突变体材料奠定了坚实的技术基础。

4 结论

在棉花中分别建立了CLCrV和TRV介导的VIGE系统, 这2个系统均可以实现棉花内源基因的定向编辑, 且基因编辑效率不存在显著差异; 使用棉花内源U6启动子或者异源U6启动子驱动sgRNA表达都可以获得高效的基因编辑效率。研究结果预示着将来可以开发更多的植物病毒应用于农作物基因编辑的研究。

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Study on VIGE system mediated by different plant viruses in cotton

LEI Jian-Feng1, LI Yue2, DAI Pei-Hong2, ZHAO Yi2, YOU Yang-Zi2, JIA Jian-Guo1, ZHAO Shuai1, QU Yan-Ying1,*, and LIU Xiao-Dong2,*

1College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University / Research Center of Cotton Engineering, Ministry of Education, Urumqi 830052, Xinjiang, China;2College of Life Sciences, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, Xinjiang, China

Plant virus-mediated sgRNA delivery and expression has tremendous advantage over traditional transformation of intact editing vectors for gene editing, because sgRNA expression can be rapidly amplified and be accumulated along with virus replication and movement, resulting in efficient gene editing efficiency. In this study, to develop and apply more plant virus-mediated gene editing (VIGE) systems in cotton, the overexpressing Cas9 (Cas9-OE) cotton was used as VIGE receptor and the cotton leaf crumple virus (CLCrV) and tobacco rattle virus (TRV) mediated VIGE systems were established in cotton. First of all, both CLCrV and TRV-mediated VIGE could target and knock out theandin subgroup A and subgroup D genomic sequences, which verified the feasibility and effectiveness of these two systems. Further quantificaiton of the editing efficiency ofandgenes by these two systems showed that both CLCrV and TRV-mediated VIGE could produce high-efficiency gene editing efficiency, and there was no significant difference in gene editing efficiency between the two systems. This study also explored the effect of sgRNAs driven by cotton endogenous U6 promoter andU6 promoter on VIGEgene editing efficiency. The results showed that both promoter-mediated VIGE were able to produce high-efficiency gene editing efficiency, and there was no significant difference in gene editing efficiency based on these two promoter-mediated VIGE systems. The above results indicate that more plant virus vectors can be developed for the application of cotton gene editing research, thus obtaining an efficient sgRNA screening system.

cotton; CLCrV; TRV; VIGE; gene editing

10.3724/SP.J.1006.2023.24071

本研究由新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2022D01B23)和自治区高校基本科研业务费科研项目(XJEDU2022J007)资助。

This study was supported by the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region (2022D01B23) and the Basic Research Funds for Universities in the Autonomous Region (XJEDU2022J007).

刘晓东, E-mail: xiaodongliu75@aliyun.com; 曲延英, E-mail: xjyyq5322@126.com

E-mail: kyleijianfeng@163.com

2022-03-30;

2022-07-21;

2022-08-17.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220816.1830.008.html

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