木薯MYB转录因子基因MeMYB60表达特征分析及其互作蛋白筛选

徐子寅 于晓玲 邹良平 赵平娟 李文彬 耿梦婷,* 阮孟斌,*

木薯MYB转录因子基因表达特征分析及其互作蛋白筛选

徐子寅1于晓玲2,3邹良平2,3赵平娟2,3李文彬2,3耿梦婷1,*阮孟斌2,3,*

1海南大学热带作物学院, 海南海口 570228;2中国热带农业科学院热带生物技术研究所 / 农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室, 海南海口 571101;3海南热带农业资源研究院 / 海南省热带农业生物资源保护与利用重点实验室, 海南海口 571101

Myeloblastosis (MYB)类转录因子在植物对非生物胁迫的响应过程中起重要调控作用。本研究在分析栽培木薯MYB家族成员表达模式的基础上, 筛选并克隆到了一个R2R3-MYB转录因子基因。基因表达特性分析表明, 该基因在叶片特异表达, 受干旱、低温负调控, 同时对ABA处理也有响应。启动子活性分析发现,可以在保卫细胞表达, 预示着该转录因子基因的表达可能与木薯气孔开闭调节有关。编码蛋白主要定位于细胞核中, 具有转录激活活性, 其转录激活结构域在蛋白C端第194～343氨基酸残基范围内。以MeMYB60蛋白N端第1～194氨基酸残基片段为诱饵, 从干旱胁迫后木薯叶片的cDNA文库中筛选到18种可能与MeMYB60互作的蛋白, 酵母双杂确定了MeCatlase1和MeCatalase2分别与MeMYB60存在互作关系。本研究为深入研究转录因子MeMYB60在木薯响应非生物胁迫过程中的功能并解析其调控网络奠定了基础。

木薯; 非生物胁迫; MYB转录因子; 表达特征; 互作蛋白筛选

MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一, 其家族成员在植物中具有多样化的功能。MYB转录因子的MYB结构域可与相应的DNA顺式作用元件结合, 许多功能基因的启动子区域都含有可被MYB转录因子识别并结合的顺式作用元件, 但不同的MYB转录因子识别的顺式作用元件在序列上存在差异[1]。通过调控下游基因的转录, MYB转录因子在植物中广泛参与了基本和次生代谢、细胞命运分化、细胞发育过程以及响应胁迫的信号传导过程中[1-7]。

在模式植物中及主要农作物中, 针对非生物胁迫相关MYB转录因子功能及调控机制的研究持续受到关注。为挖掘木薯非生物胁迫相关MYB转录因子基因, 本实验室利用PFAM数据库中的MYB保守结构域PF00249 (myb-like DNA-binding domain)对木薯基因组进行BLAST分析(http://www.phytozome. net/), 获得318个具有完整开放阅读框的MYB类基因序列[8]。另外, 部分R2R3-MYB转录因子基因与干旱胁迫条件下木薯叶片的脱落有关[9]。通过全基因组关联分析, 研究人员发现木薯基因可能与木薯叶片宽度有关[10]。随后, 通过目标基因重测序及关联分析证实了与木薯抗旱性显著相关, 是一个潜在的、可用于木薯遗传改良的候选基因[11]。基于基因表达分析结果, 本实验室在转基因木薯中验证了转录因子的抗逆功能,发现该转录因子基因负调控木薯对干旱和低温的耐受性[8]。进一步研究发现负调控木薯叶片失水率, 并且可以与气孔开闭调节相关蛋白互作[12]。

气孔是陆地植物与外界环境之间进行气体和水分交换的主要结构, 气孔密度及开闭调节是植物应对干旱胁迫的重要调控方式[13]。模式植物中的研究表明, MYB转录因子在气孔发育及开闭调节过程中均起着重要的作用[1]。例如, 拟南芥MYB类转录因子GTL1可以与启动子区上的GT顺式作用元件结合, 抑制基因的转录, 从而控制气孔的发育, 影响气孔密度[14-16]。最近, 有研究者发现拟南芥的表达直接影响到气孔的分布[17]。MYB转录因子除在气孔发育过程起重要调控作用以外, 在气孔运动调节过程中也起着关键作用。例如, 拟南芥可特异在保卫细胞中表达, 通过调控脂氧化物的合成参与气孔开闭调节, 影响植物抗旱性[18-20]。拟南芥也可以在保卫细胞中表达, 过表达该基因的拟南芥叶片气孔孔径明显缩小, 对ABA诱导的气孔关闭更加敏感[21]。在干旱胁迫条件下, 拟南芥参与ABA信号传导, 通过调控气孔关闭和表皮腊质合成影响植株的抗旱性[22-23]。

木薯(Crantz)是一种重要的热带作物, 其块根的碳水化合物含量可达38%, 并且含有多种维生素, 是全球近10亿人口的主要营养来源[24]。木薯在幼苗期易受干旱和低温等环境危害, 提高栽培品种的抗逆能力是保障木薯产量和品质的重要前提, 挖掘木薯抗逆基因可为通过遗传改良培育抗逆木薯新品种提供基因资源和改良策略。本文利用同源比对法克隆了木薯基因, 分析了该基因在木薯不同组织中的特异表达模式以及对干旱、低温和ABA处理的响应。通过启动子特性分析发现可以在保卫细胞特异表达。具有明显的转录激活功能, 其编码蛋白主要定位于细胞核中。本文通过酵母双杂系统从木薯叶片cDNA文库中筛选到部分可能与MeMYB60互作的候选蛋白, 并初步验证了MeMYB60与2个过氧化氢酶的互作关系。研究结果为进一步研究的功能及分子机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

野生型烟草(本生烟)、野生型拟南芥(Col-0)、木薯品种cv.60444均由本实验室保存。将木薯成熟茎杆分成约30 cm的茎段, 扦插于装满基质(沙土∶营养土∶蛭石)的花盆中置于玻璃温室中培养, 萌发后生长60 d的盆栽苗用作试验材料。以停水的方式对木薯盆栽苗进行干旱处理, 以正常供水的盆栽苗为对照。监测土壤相对含水量, 浇水当天土壤相对含水量为25%～35%之间, 浇水后的第4天选取土壤相对含水量为10%左右的盆栽苗继续进行干旱处理, 2 d后取土壤相对含水量为2.5%左右的盆栽苗进行取样。分别收集对照和处理植株的成熟叶片, 选择从顶芽开始往下的第4、第5、第6三片成熟叶片于液氮中速冻,-80℃保存备用。将盆栽苗移入控温培养箱, 以8～10℃的温度对盆栽苗进行低温处理, 处理12 h后收集成熟叶片; 以100 µmol L–1的ABA溶液喷施成熟叶片, 以水喷施叶片作为对照, 处理12 h后收集叶。各处理的样品在采样时放入液氮速冻, –80℃保存备用。启动子分析所用的转基因拟南芥通过花序侵染法[25]转化野生型拟南芥获得。

多糖多酚植物总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司(目录号: DP441); 反转录试剂盒(目录号: D2639A)和qRT-PCR所用的SYBR Premix ExII Kit (目录号: DRR081A)购自宝生物有限公司; 各种引物合成以及载体测序由上海生工生物工程有限公司完成; 2´PCR反应体系购自天根生化科技(北京)有限公司(目录号: KT201-02); PCR产物回收纯化试剂盒(目录号: DR02)、质粒提取试剂盒(目录号: PL03)购自艾德莱生物有限公司; 大肠杆菌DH5a、农杆菌GV3101和酵母Y2HGold感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司; Clontech酵母双杂交试剂盒(目录号: 630489)及酵母培养基购自宝生物有限公司; 植物表达载体由本实验室改造保存。

1.2 总RNA提取及cDNA合成

按照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书提取各冻存材料的总RNA。按反转录试剂盒操作说明合成cDNA作为PCR反应的模板。

1.3 MeMYB60基因克隆

根据NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ protein)中木薯XP_021622445.1编码基因的序列信息, 设计了相应的PCR引物, 用于克隆基因全长片段, 具体引物信息见表1。以木薯cv.60444盆栽苗成熟叶片的cDNA为模板, 以_I_R I_5'和H I_3¢为引物, 通过PCR克隆了开放阅读框的全长, 并测序验证了全长序列的准确性。

1.4 生物信息学分析

在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ protein)中下载了包括拟南芥在内的其他21种植物的MYB60蛋白序列, 以MEGA7 (V7.0.14)软件对蛋白的氨基酸序列进行分析, 利用Neighbor-Joining法构建了系统进化树。利用VectorNTI (V10.3.0)软件包中的AlignX分析了木薯XP_021622445.1与MeMYB2以及橡胶树、拟南芥、蓖麻中MYB60蛋白氨基酸序列的同源性。

1.5 MeMYB60基因表达模式分析

根据从木薯cv.60444中获得基因全长序列信息设计qRT-PCR引物_QP1和_QP2 (表1), 以Phytozome数据库中木薯()为内参基因, 设计引物_QP1和_QP2 (表1)。以各材料的cDNA为模板, 先通过半定量PCR确定基因在木薯叶片、叶柄和根的组织表达特异性, 再通过qRT-PCR分析不同处理条件下基因在木薯叶片中的表达差异。qRT-PCR反应按宝生物公司SYBR Premix ExII Kit (目录号: DRR081A)操作说明书进行。基因相对表达量以2–DDCt来计算。以GraphPad Prism 6.0软件对数据进行计算分析并作图。

表1 PCR引物名称及序列

1.6 亚细胞定位

通过I和H I内切酶位点将基因全长片段分别与植物表达载体上的融合, 构建植物表达载体, 测序正确的质粒转化农杆菌GV3101, 以载体为对照, 经鉴定后的农杆菌工程菌用于按照烟草瞬时转化的方法注射烟草叶片下表皮, 注射3 d后观察绿色荧光蛋白的亚细胞定位。

1.7 启动子活性分析

在Phytozome木薯基因组数据库(https:// phytozome-next.jgi.doe.gov/,V8.1)中查询(Manes.09G135700.1)序列信息, 以其编码区起始密码ATG上游1500 bp片段为启动子区, 设计相应引物(表1)。以木薯cv.60444基因组DNA为模板, 利用_Promoter_5'和HI3'引物, 通过PCR方法克隆包括编码区DNA片段和起始密码ATG上游1500 bp的基因组DNA片段, 测序验证序列的准确性。利用MeMYB60_promoter_I_5'和MeMYB60_ promoter_I_3'为引物克隆启动子, 通过I和I内切酶位点将测序正确后的启动子片段替换植物表达载体上的CMV 35S启动子, 构建载体。经测序正确质粒转化农杆菌GV3101, 随后转化野生拟南芥, 在含潮霉素的1/2 MS固体培养基上筛选转化后的种子以获得阳性植株, 将后代分离比符合3∶1的植株用于启动子活性分析。通过观察GFP蛋白的绿色荧光定位来分析启动子转录调控的组织特异性。

1.8 转录自激活活性分析

通过R I和H I内切酶位点将基因编码区全长片段插入酵母表达载体中, 构建载体为了确定MeMYB60转录激活结构域所在位置, 利用PCR对基因3¢端进行部分删除, 获得一系列3¢端删除片段, 利用R I和H I内切酶位点分别将不同的截短片段插入载体, 构建、和载体。以上测序正确的质粒分别转化酵母Y187菌株。分别挑取经鉴定后的转化酵母菌株以0.9%的NaCl溶液重悬并稀释不同浓度后点在SD/-Trp/AbA/ X-α-Gal培养基上, 根据是否形成蓝色菌斑判断相应插入片段是否具有转录自激活活性, 以此推断MeMYB60转录激活结构域所在位置。

1.9 酵母双杂筛选MeMYB60互作蛋白

以无转录自激活活性的MeMYB60-194为诱饵蛋白, 利用本试验已建好的木薯叶片cDNA文库筛选可能与MeMYB60互作的蛋白。筛选方法按酵母双杂交试剂盒说明书进行。

根据和基因的编码序列设计了相应的引物, 通过PCR对木薯cv.60444成熟叶片的cDNA进行扩增, 将测序验证后的和基因片段分别插入和载体, 构建、、、载体, 测序验证; 将基因全长插入, 构建载体, 测序验证。将已构建好的、以及空载体分别与成对共转化酵母Y2HGold感受态细胞; 将、空载体分别与成对共转化酵母Y2HGold感受态细胞。在DDO (SD/-Trp-Leu)酵母培养基上筛选阳性单菌落, 分别以和载体上的通用引物进行菌落PCR以鉴定共转化的阳性菌株。经鉴定的阳性菌落以0.9%的NaCl溶液重悬并点在QDO/A/X (SD/-Trp-Leu-His-Ade/AbA/X-a-Gal)培养基上培养至蓝色菌斑出现。

2 结果与分析

2.1 MeMYB60基因克隆

在前期的研究中发现木薯中与拟南芥AtMYB60 (AT1G08810)蛋白序列同源性较高的MYB蛋白有2个(XP_021622445.1和XP_021619967.1), 对XP_021619967.1 (MeMYB2)的功能进行了研究[8,12]。本文基于XP_021622445.1 (MeMYB60)编码基因的序列设计了用于克隆基因编码区全长的引物, 以木薯cv.60444成熟叶片的cDNA为模板进行PCR扩增, 获得编码区全长大小约1000 bp (图1)。测序结果表明该PCR片段全长1035 bp, 包含了完整的开放阅读框, 与木薯基因组数据库(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/,V8.1)中编号为的基因序列完全一致。

2.2 MeMYB60蛋白进化树及序列比对分析

将木薯MeMYB60蛋白与其他21种植物的MYB60蛋白进行进化树分析发现, 木薯MeMYB60蛋白与橡胶树()、杨树()和蓖麻()的亲缘关系最近, 其氨基酸序列的一致性分别达到了76.1% (橡胶树)、69.7% (杨树)和64.3% (蓖麻)。而与玉米()和大豆()的亲缘关系最远, 其氨基酸序列的一致性分别为41.0% (玉米)、43.8% (大豆) (图2)。

将木薯MeMYB60与MeMYB2以及拟南芥、橡胶树、蓖麻MYB60蛋白的氨基酸序列进行比对发现, MYB60在其蛋白的N端120个氨基酸残基内有很高的相似性, 这部分氨基酸残基主要是MYB类转录因子的R2和R3保守结构域。在MeMYB60蛋白第177到第198氨基酸残基有一段22个氨基酸残基的片段在不同的植物中高度保守(图3), 这段高度保守的序列可能与MYB60的功能密切相关。

图1 木薯叶片RNA及MeMYB60基因PCR扩增产物电泳图

图3 木薯MeMYB60与其他植物的同源蛋白氨基酸序列比对

黑色区块: 氨基酸一致性为100%。Black blocks: the amino acid identity is 100%.

2.3 MeMYB60基因表达分析

利用RT-PCR对基因在木薯cv.60444植株不同组织中的表达情况进行分析发现,基因主要在木薯叶片(leaf)和叶柄(petiol)中优势表达, 而在根部(root)的表达量极低(图4-A)。利用qRT-PCR分析对不同环境胁迫处理的响应发现, 在干旱、低温和ABA处理下, 该基因在木薯成熟叶片中的表达量均显著下调(图4-B)。

2.4 MeMYB60蛋白亚细胞定位

通过瞬时转化烟草的方法分析MeMYB60蛋白的亚细胞定位。将携带质粒的农杆菌注射烟草叶片下表皮, 3 d后取注射部位周边直径1 cm范围内的叶片, 在激光共聚焦显微镜下观察叶片下表皮细胞中绿色荧光蛋白的定位。以细胞核荧光染料Hoechst33342 (ThermoFisher公司, 目录号: 62249)对表皮细胞的细胞核进行染色。结果如图5所示, 绿色荧光信号与蓝色荧光信号位置重叠, 表明MeMYB60:eGFP融合蛋白主要集中在细胞核中。

图4 木薯MeMYB60表达的组织特异性分析(A)及其在叶片中对不同胁迫的响应分析(B)

内参基因为。**表示不同处理样品与对照样品(Control)相比差异极显著(< 0.01)。误差线为每组处理的标准误差(= 3)。

was used as a home keeping gene. ** indicates significant differences at< 0.01 in samples for different treatments compared to the sample of control. Error bar represents the standard error of each sample (= 3).

图5 MeMYB60-eGFP融合蛋白的亚细胞定位

2.5 MeMYB60启动子特异性分析

研究表明, 拟南芥的基因可以在保卫细胞中特异表达[18]。为了进一步明确木薯基因的表达特性, 本文通过PCR从木薯cv.60444基因组DNA中扩增了起始密码子ATG上游1500 bp的片段, 构建了植物表达载体。通过农杆菌介导转化野生型拟南芥(Col-0), 获得转基因植株后在激光共聚焦显微镜下观察转基因拟南芥叶片下表皮中绿色荧光蛋白的定位。绿色荧光蛋白的定位结果显示,启动子可以驱动融合基因在拟南芥保卫细胞中表达(图6), 表明基因有可能是在木薯保卫细胞中特异表达。

2.6 MeMYB60蛋白序列及转录激活结构域分析

蛋白序列分析结果表明木薯MeMYB60属于R2R3-MYB亚家族成员, 具有2个保守的DNA结合结构域(图7-A)。MeMYB60全长蛋白(MeMYB60-full)具有明显的转录自激活能力, 在酵母Y187菌株中可以激活报告基因的表达, 从而在SD/-Trp/ A/X酵母培养上生长并形成蓝色菌斑(图7-B)。按图7-A所示, 通过PCR获得了一系列MeMYB60蛋白C末端删除片段, 构建了酵母表达载体并转化Y187菌株, 在SD/ -Trp/A/X培养基上对MeMYB60蛋白截短片段的转录激活功能进行分析。在SD/-Trp培养基上, MeMYB60蛋白全长及各截短蛋白片段相关载体转化的酵母与空载体转化的酵母生长能力一致(图7-B), 说明MeMYB60蛋白不影响酵母的正常生长, 对酵母细胞没有毒性。如图7所示, MeMYB60-234蛋白片段可以激活报告基因的表达, 在SD/-Trp/A/X培养基上形成蓝色菌斑; 而MeMYB60-194片段不能激活报告基因的表达, 无法在SD/-Trp/A/X培养基上形成蓝色菌斑。表明, MeMYB60的转录激活结构域在第194至234氨基酸残基范围内。

2.7 MeMYB60互作蛋白筛选

转录激活结构域分析试验表明, MeMYB60-194蛋白片段对酵母细胞没有毒性, 且该片段无转录激活功能。为了筛选MeMYB60的互作蛋白, 本文以MeMYB60-194蛋白片段为诱饵, 通过酵母双杂交系统从木薯cv.60444成熟叶片cDNA文库中筛选可能与MeMYB60互作的部分蛋白。酵母双杂获得的阳性克隆经2次划线纯化后, 以酵母表达载体上的通用引物对不同的单克隆进行菌落PCR。将条带单一且片段在500 bp以上的PCR产物回收并测序。从测序结果中筛选具有完整开放阅读框的序列, 通过BLAST在木薯基因组(https:// phytozome-next.jgi.doe.gov/,V8.1)进行比对和注释, 部分结果见表2。从结果中发现, 可能与MeMYB60-194片段互作的蛋白包括2个不同的过氧化氢酶(Catalase), 基因登录号分别为Manes.05G130500.1 (MeCAT1)和Manes.02G113300.1 (MeCAT2)。

图6 MeMYB60:eGFP融合基因在MeMYB60启动子驱动下的表达分析

图7 MeMYB60蛋白序列及转录激活结构域分析

2.8 MeMYB60与过氧化氢酶互作验证

利用酵母双杂系统, 通过点对点的方式对MeMYB60与过氧化氢酶(MeCAT1和MeCAT2)蛋白之间的互作关系进行验证。由图8可知, 转化MeCAT1 + MeMYB60-194、MeCAT2 + MeMYB60- 194 的酵母可以在QDO/A/X平板上长出蓝色菌斑; 通过交换载体以进一步确认MeMYB60完整蛋白是否可以与MeCAT1和MeCAT2互作, 发现转化MeMYB60-full + MeCAT1、MeMYB60-full + MeCAT2的酵母可以在QDO/A/X平板上长出蓝色菌斑, 而共转化单个基因和空载体的酵母均未能在形成蓝色菌斑。以上结果进一步说明MeCAT1和MeCAT2可能与MeMYB60存在蛋白互作关系。

表2 MeMYB60酵母cDNA文库筛选结果

图8 酵母双杂验证MeMYB60与木薯过氧化氢酶的蛋白互作关系

3 讨论

已有的研究表明MYB类转录因子在植物响应非生物胁迫的过程中起重要作用。木薯基因组以及大量重测序数据的公布[26-29], 为进一步挖掘木薯抗逆功能基因奠定了重要的基础。本实验室在前期的研究中筛选到多个非生物胁迫相关的MYB类转录因子[8], 为进一步研究木薯MYB类转录因子的抗逆功能提供参考依据。本文着重对木薯中拟南芥的同源基因的表达特性和互作蛋白进行了分析, 为进一步研究该基因的功能和调控机制奠定基础。

气孔运动调控对于植物响应干旱等非生物胁迫有重要的意义, 研究表明, 拟南芥基因在叶片优势表达, 在花和根部的表达量极低[18-19]。另外, 海岛棉的基因也是在叶片优势表达, 并且其在叶片中的表达对多种非生物胁迫均有明显的响应[30]。RT-PCR结果表明, 木薯基因同样在叶片(包括叶柄)的优势表达, 而在根部的表达量极低(图4-A)。在干旱及ABA处理条件下, 拟南芥基因的表达量明显下降[18-19], 本文qRT-PCR的结果显示, 干旱、低温和ABA等处理负调控基因在木薯成熟叶片中的表达(图4-B)。以上试验结果表明, 木薯与拟南芥在非生物胁迫条件下有相似的表达调控模式。结合木薯启动子可以驱动报告基因在保卫细胞中表达的试验结果(图6), 暗示着基因可能参与了非生物胁迫条件下木薯气孔的开闭调节。我们前期的研究表明, 木薯中拟南芥的另一个同源基因负调控木薯叶片的失水率, 从而影响转基因木薯的干旱耐受性[12]。本文中的是否确实参与木薯气孔运动调节并影响木薯抗逆性, 还需要通过制备相应的转基因木薯来进一步验证其功能。

转录因子在植物非生物胁迫响应调控中的功能和机制研究持续受到关注。近期, 我们实验室报道了木薯干旱胁迫相关的SPL (SQUAMOSA promoter binding protein-like)转录因子MeSPL9在转录水平上负调控茉莉酸、脯氨酸和花青素等干旱逆境响应相关的代谢物关键合成酶基因的表达, 以此影响木薯抗旱性[31]。亚细胞定位及转录自激活试验结果(图4和图7)显示,编码蛋白主要定位于细胞核中, 具有明显的转录自激活活性, 表明该基因编码的蛋白可能是一个转录因子。多数MYB转录因子可以与序列为CAACTGG的DNA顺式作用元件结合, 我们前期的研究发现, 木薯MeMYB2可以与上述DNA顺式作用元件结合, 而MeMYB60却不能与该顺式作用元件结合[8]。因此, 木薯MeMYB60所识别并结合的DNA顺式作用元件还需要通过进一步的试验来确定。

胁迫相关转录因子常与其互作蛋白协同调控木薯对非生物胁迫的响应。利用病毒介导的基因沉默系统, 研究人员发现木薯MeCIPK23蛋白通过与转录因子互作, 调控脱落酸(ABA)合成并影响木薯的抗旱性[32]。另外, 我们还发现木薯MeGRXC3通过在细胞核中与TGA转录因子互作调控转基因拟南芥对渗透胁迫的耐受性和体内活性氧的累积[33]。此外, 木薯转录因子MeRAV5可与过氧化物酶MePOD和肉桂醇脱氢酶MeCAD15互作, 调控过氧化氢(H2O2)和木质素的累积, 从而影响木薯抗旱性[34]。可见, 筛选互作蛋白是研究转录因子功能和分子调控机制的重要前提。本文通过酵母双杂系统, 从木薯cv.60444成熟叶片cDNA文库中筛选到了部分可能与MeMYB60互作的蛋白, 并且初步验证了MeMYB60与过氧化氢酶MeCAT1和MeCAT2之间的互作关系(图8), 为进一步研究MeMYB60的功能奠定了基础。

过氧化氢酶是细胞内清除活性氧的主要酶类之一, 其活性与植物的抗逆性有密切关联。协同过表达SOD和CAT的转基因木薯, 其细胞内清除活性氧的能力明显提高, 从而导致转基因木薯对干旱和低温的耐受性明显提高[35]。最近, 研究人员发现木薯热激蛋白MeHSP90可以招募转录因子MeWRKY20和过氧化氢酶MeCAT1来影响细胞内活性氧水平并调控木薯的抗旱性[36]。活性氧在保卫细胞产生并累积对于气孔的关闭是非常重要[37], 本文的试验结果显示, MeMYB60与过氧化氢酶之间存在蛋白互作关系, 这可能意味着MeMYB60参与了保卫细胞中活性氧的平衡调节过程, 并以此影响气孔开闭。

4 结论

本文克隆到了一个在木薯叶片优势表达的R2R3-MYB转录因子基因。干旱、低温以及ABA处理抑制该基因在木薯成熟叶片中的表达, 且启动子可以驱动报告基因在保卫细胞中表达。MeMYB60蛋白主要定位于细胞核中, 其转录激活结构域在第194～234氨基酸残基之间。MeMYB60可能通过与过氧化氢酶互作来调控保卫细胞内的活性氧信号。

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Expression pattern analysis and interaction protein screening of cassava MYB transcription factor

XU Zi-Yin1, YU Xiao-Ling2,3, ZOU Liang-Ping2,3, ZHAO Ping-Juan2,3, LI Wen-Bin2,3, GENG Meng-Ting1,*, and RUAN Meng-Bin2,3,*

1College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou 570228, Hainan, China;2Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, Hainan, China;3Key Laboratory for Biology and Genetic Resources of Tropical Crops of Hainan Province, Hainan Institute for Tropical Agricultural Resources, Haikou 571101, Hainan, China

Myeloblastosis (MYB) transcription factors widely involve in a variety of physiological and biochemical processes in plants, and play important regulatory roles in response to abiotic stress in plant. Based on the expression pattern of MYB members in cassava cultivars, an R2R3-MYB transcription factor, namely MeMYB60 was screened and cloned. Gene expression characteristics showed thatwas specifically expressed in leaves of cassava, and negatively regulated by drought stress and low temperature. Moreover, this gene was also responded to ABA treatment in leaves of cassava. Promoter activity analysis showed thatcould be expressed in guard cells, indicating that the expression of this transcription factor gene may be related to stomatal movement regulation in cassava. MeMYB60 protein was predominately located in the nucleus and had transcriptional activation activity. Its transcriptional activation domain was in the range of 194th–343rd amino acid residues at the C-terminal of the protein. The cDNA library of drought stressed cassava leaves was screened by using the 1st–194th amino acid residues at the N-terminal of MeMYB60 protein as bait. Subsequently, 18 proteins had been that may interact with MeMYB60. Yeast-two-hybrid analysis determined that MeCatlase1 and MeCataase2 are potential interactors of MeMYB60, respectively. These results lay a foundation for further functional study ofin cassava in response to abiotic stress and are helpful for the regulatory network investigation of.

cassava; the abiotic stress; MYB transcription factor; the relative expression pattern; the interaction protein screening

10.3724/SP.J.1006.2023.24089

本研究由国家重点研发计划项目(2018YFD1000501), 海南省重大科技计划项目(ZDKJ2021012)和中央级公益科研院所基本科研业务费专项(1630052022036)资助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2018YFD1000501), the Major Science and Technology Plan of Hainan Province (ZDKJ2021012), and the Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund for Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences (1630052022036).

阮孟斌, E-mail: ruanmengbin@itbb.org.cn; 耿梦婷, E-mail: mengtinggeng8908@163.com

E-mail: 670307392@qq.com

2022-04-10;

2022-07-21;

2022-08-22.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220819.1427.006.html

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