白兔局部动脉粥样硬化不稳定斑块对其余血管斑块形成的影响

陆 琦，鲍迎春，陈旭姣，王春明

1宁波大学附属人民医院心内科，浙江 宁波 315040；2宁波市医疗中心李惠利医院东部院区特检科，浙江 宁波315048

众所周知，动脉粥样硬化（AS）以动脉管壁脂质沉积所致血管管壁增厚变硬、管腔缩小为主要特征，其作为脑卒中、主动脉夹层、冠心病等众多心血管疾病发生的重要病理学基础，是导致心血管疾病患者死亡的主要原因［1-4］。因此，对动脉粥样硬化斑块形成机制的研究显得尤为重要。由于AS发病与年龄、性别、吸烟、高血压、糖尿病、高血脂、肥胖等多种因素有关，当前对动脉粥样硬化斑块形成机制的研究大多着眼于血脂、血糖等外周循环血中的各种危险因素对动脉内膜的影响［5-7］，但是动脉粥样硬化不稳定斑块对外周其他血管的斑块形成或者加重造成影响的作用机制仍有待研究。因此，本研究选用技术较为成熟且公认较为有效的球囊损伤术联合高脂喂养来建立动脉粥样硬化不稳定斑块模型，探讨局部动脉粥样硬化不稳定斑块对其余动脉粥样硬化斑块形成的影响，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性成年新西兰白兔30只，体质量2.0～3.0 kg。购买、饲养于宁波大学医学院动物实验中心，所有兔子均按普通级标准单笼饲养，正常光照，提供足够的食物和水，总共饲养12周。本研究经院伦理委员会批准，且本研究动物实验遵循中国动物护理和机构伦理指导方针。

1.1.2 主要材料和试剂 高脂饲料（含1%胆固醇、6%猪油、10%蛋黄粉及83%基础饲料，购自南京索菲特饲料有限公司）；无水乙醇（华东医药股份有限公司）；福尔马林（湖北秦康医疗设备有限公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）溶液（Hyclone）；苏木精-伊红染色（HE）染色液（上海谱振生物科技有限公司）；庆大霉素（哈药集团制药总厂）；青霉素哈药集团制药总厂）；高密度胆固醇（HDL-C）测定试剂盒（吉斯生物科技有限公司）；低密度胆固醇（LDL-C）测定试剂盒、超敏C反应蛋白（CRP）测定试剂盒、总胆固醇（TC）测定试剂盒、甘油三酯（TG）测定试剂盒（吉斯生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立及取材 所有新西兰白兔按照随机数字表法随机分为3组，10只/组。实验组和对照组予以高脂饲料喂养，空白组予以普通饲料喂养。实验组兔子高脂喂养4周后，行单侧颈动脉球囊损伤手术。之后各组均按照原先计划喂养至12周，采静脉血后处死，取颈动脉、腹主动脉进行病理组织学检测，采集兔耳缘静脉的静脉血，分离血浆测定血脂和CRP。

1.2.2 颈动脉球囊损伤术 用球囊损伤颈总动脉手术具体步骤：经耳缘静脉注射3%戊巴比妥麻醉兔子，每公斤体质量1 mL，手术台上固定兔子颈部，除净颈部兔毛后先用手术刀切开颈部皮肤，用止血钳一层层仔细分离组织和血管，将周围结缔组织、脂肪组织与颈总动脉、颈内动脉相互分离，各分支血管分别用血管钳结扎，用眼科剪在颈总动脉上切开一小口，插入球囊，用注射器注入空气以扩张球囊，来回推拉3次，然后抽出球囊并缝合伤口，松开血管夹，观察兔子无出血后仔细缝合皮肤切口，并于兔子大腿肌肉注射100万单位青霉素注射液预防感染。

1.2.3 组织病理学检查 实验第12周末，将各组兔子全部处死，于麻醉状态下离取双侧颈动脉以及腹主动脉3～4 cm。用生理盐水冲洗并简单处理外膜脂肪组织后，置于福尔马林溶液中固定24 h，然后进行梯度乙醇脱水，二甲苯清除，嵌入石蜡，切成5 μm的切片，冷却后，切片用苏木精染色4 min，并在室温下用盐酸酒精分化数秒。随后将切片置于蒸馏水中一段时间，依次用70%乙醇和90%乙醇脱水。然后，将切片在室温下用伊红染色2 min，进行梯度乙醇脱水，二甲苯清洗。用中性密封胶封片后，在光学显微镜（THUNDER Imager，德国Leica）下观察组织形态学改变并拍照。

1.2.4 血脂及CRP检测 各组第12周末处死之前，均通过经耳缘静脉采血的方法抽取空腹血。将获得的血液液标本离心后静置取血浆，用全自动生化分析仪检测TG、TC、LDL-C、HDL-C以及CRP水平，相关操作按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计分析

本研究所有计量数据均应用SPSS16.0 以及EXCEL 统计软件行数据分析，所有计量资料均符合正态分布，并以均数±标准差的方式表示。三组之间比较运用单因素方差分析进行分析比较，以P＜0.05为组间差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 动物一般情况

在12周的动物建模实验过程中，实验组出现2例术后感染，及时采取局部注射青霉素以及酒精消毒等措施后好转，至12周末各组均无死亡。4周末、8周末、12周末时，实验组、对照组体质量较0周时明显升高（P＜0.05），空白组体质量较0周时无明显差异（P＞0.05），且空白组体质量明显低于实验组、对照组（P＜0.05），对照组间体质量比较无明显差异（P＞0.05，表1）。

表1 各组实验动物体质量表Tab.1 Body weight changes in the 4 groups at different time points(kg)

2.2 苏木素-伊红染色结果

实验12周末，将各兔子全部处死后采集双侧颈动脉以及腹主动脉进行病理组织学检查。实验组颈动脉以及腹主动脉有明显动脉粥样通硬化斑块形成，有串珠样改变，弹性也较其余两组血管差，血管内面解剖亦可见明显动脉粥样硬化形成。显微镜下的动脉粥样硬化斑块纤维帽薄，脂质核大，且部分斑块已出现出血、破裂甚至血栓形成，是典型的动脉粥样硬化不稳定斑块。同时，实验组颈动脉以及腹主动脉存在各种程度的管腔狭窄以及内中膜增生，显微镜下可见血管内大量平滑肌细胞增生并向内膜方向迁移，内含胆固醇的泡沫细胞堆积在在血管内膜下面，双侧颈动脉以及腹主动脉均可见血管弹力板走行紊乱（图1～3）。对照组血管外观和显微镜下结构大体与实验组血管类似，可见血管内膜轻度增生，但是各血管中膜无增生，同时，对照组各血管亦未见血管内脂质沉积，亦无明显粥样斑块形成，（图4、5）。空白组颈动脉以及腹主动脉外表光滑有弹性，显微镜下解剖血管内表面也光滑平整，血管内膜及中膜无明显增生，各动脉内弹力板清晰完整，显微镜下平滑肌细胞结构完好，血管内无脂质沉积，且无明显动脉粥样斑块形成（图6、7）。

图1 12周实验组损伤侧颈动脉Fig.1 Injured carotid artery in atherosclerosis model group at 12 weeks(HE staining,original magnification:×200).

图2 12周实验组对侧颈动脉Fig.2 Contralateral carotid artery in atherosclerosis model group at 12 weeks(HE staining,×200).

图3 12周实验组腹主动脉Fig.3 Abdominal aorta in atherosclerosis model group at 12 weeks(HE staining,×200).

图4 12周对照组颈动脉Fig.4 Carotid artery in atherosclerosis model group at 12 weeks(HE staining,×200).

图5 12周对照组腹主动脉Fig.5 Abdominal aorta in high-fat feeding group at 12 weeks(HE staining,×200).

图6 12周空白组颈动脉Fig.6 Carotid artery in normal chow feeding (blank control)group at 12 weeks(HE staining,×200).

2.3 组织病理学评估

经过12周的喂养后，实验组可见手术侧颈动脉、对侧颈动脉、腹主动脉均有明显动脉粥样硬化斑块形成，对照组与空白组各部位血管均无明显动脉粥样硬化斑块形成。实验组平均内膜厚度明显大于对照组、空白组（P＜0.05），且实验组手术侧颈动脉平均内膜厚度、斑块面积与管腔面积明显大于对侧颈动脉、腹主动脉（P＜0.05，表2）。

表2 12周各组各部位血管病理结果Tab.2 Pathological results of blood vessels in each group at 12 weeks

图7 12周空白组腹主动脉Fig.7 Abdominal aorta in blank control group at 12 weeks(HE staining,×200).

2.4 血脂检测结果

12周末时，实验组、对照组TG、TC、LDL-C、HDL-C、CRP水平明显高于空白组（P＜0.05），且对照组间TG、TC、LDL-C、HDL-C、CRP水平比较无明显差异（P＞0.05），实验组CRP水平明显高于对照组（P＜0.05，表3）。

表3 12周末各组血脂水平Tab.3 Blood lipid and CRP levels in the 3 groups at 12 weeks

3 讨论

目前，冠心病已成为当今世界最重要的死亡因素，而动脉粥样硬化斑块作为心血管疾病的基础病变在冠心病等心血管疾病中发挥着重要作用［8-12］。除动脉粥样硬化斑块的解剖生理学特征之外，斑块的不稳定性是引起临床后遗症的最主要因素［13-18］。动脉粥样硬化不稳定斑块一般有以下特点：低密度脂蛋白填充的泡沫细胞组成的大脂质核、薄纤维帽、大量炎症细胞浸润、新生的血管以及外向重塑［19-23］。尽管关于动脉粥样硬化不稳定斑块已有较多研究，但是动脉粥样硬化不稳定斑块破裂释放的物质是否会作用于外周的大血管动脉粥样硬化的形成仍有待研究，本实验即想通过动物建模的方法验证这个猜想。

本研究实验组和对照组予以高脂饲料喂养，空白组予以普通饲料喂养。喂养4周后，对实验组的兔子通过球囊损伤术进行动脉粥样硬化建模，而后进行一般情况观察，取颈动脉、腹主动脉进行病理组织学检测，结果显示，4周末、8周末、12周末时，空白组体质量明显低于实验组、对照组，对照组间体质量比较无明显差异；12周末时，实验组实验组的各部位动脉从外观及内面解剖可见明显动脉粥样硬化斑块形成及内膜增生，有串珠样改变。对照组可见血管内膜轻度增生，无明显粥样斑块形成。空白组血管内膜及中膜无明显增生，无明显动脉粥样斑块形成。实验组平均内膜厚度明显大于对照组、空白组，且实验组手术侧颈动脉平均内膜厚度、斑块面积与管腔面积明显大于对侧颈动脉、腹主动脉；说明局部动脉粥样硬化不稳定斑块可促进其余动脉粥样硬化斑块的形成。

CRP是人体肝脏合成的时相蛋白，其水平增加，可上调下游白细胞介素（IL）-6、IL-8等炎症因子的活性，促进低密度脂蛋白对于血管内皮的侵袭，进而损伤血管内皮，使血管黏附因子表达增加，动脉硬化斑块破裂，导致局部血栓形成［24-27］。除此之外，机体血脂水平升高亦是动脉粥样硬化斑块形成的重要原因［28-30］。为进一步研究局部动脉粥样硬化不稳定斑块促进其余动脉粥样硬化斑块形成的机制，本研究检测12 周末各组TG、TC、LDL-C、HDL-C、CRP水平，结果显示，12周末时，实验组、对照组TG、TC、LDL-C、HDL-C、CRP水平明显高于空白组，且对照组间TG、TC、LDL-C、HDL-C、CRP水平比较无明显差异，实验组CRP水平明显高于对照组，说明局部动脉粥样硬化不稳定斑块可通过升高机体CRP水平，促进其余动脉粥样硬化斑块的形成。

综述所述，局部动脉粥样硬化不稳定斑块可促进其余动脉粥样硬化斑块的形成，主要通过上调机体CRP水平发挥作用。可为动脉粥样硬化的研究和临床治疗提出了一个崭新的方向。