核因子E2相关因子2介导的铁死亡在糖尿病心肌病中的发病机制及其靶向治疗研究进展

郭源辉，段佳佳，刘传鑫，姜宏卫

(1.河南科技大学临床医学院,河南 洛阳 471003;2.河南科技大学第一附属医院内分泌代谢中心,河南 洛阳 471003;3.河南省罕见病实验室,河南 洛阳 471003;4.河南科技大学第一附属医院检验科,河南 洛阳 471003)

作为一种铁依赖性细胞死亡类型,铁死亡的核心机制为氧化还原失衡与脂质氢过氧化物积累,其在细胞形态、生物化学与遗传学方面具有独特的特征[1-2]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是以左心室舒张功能受损和心功能不全为主要特征的心肌病变。DCM发病机制多样,包括高血糖、炎症、氧化应激、内皮细胞受损、心肌细胞肥大与纤维化等,氧化应激常在DCM发病机制中起关键作用[3]。核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,NRF2)通过调节维持细胞氧化还原的多种抗氧化剂来发挥重要作用[4],此调节过程包括谷胱甘肽调节基因、辅酶Ⅱ/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)再生基因、脂质过氧化基因和铁调节基因等编码与铁死亡有关的抗氧化剂基因[5-6]。有研究证明,通过激活NRF2下调氧化应激水平来抑制铁死亡可能是DCM潜在治疗途径[7-8]。ZANG等[9]研究发现,糖尿病可能导致NRF2关闭其所介导的防御,并启动心肌细胞铁死亡病理过程,进而恶化DCM。基于大量研究结果发现,NRF2介导的铁死亡在DCM病理过程中起到关键作用。本文就铁死亡机制、铁死亡与DCM之间的关系进行概述,并重点就NRF2分子机制、生物学功能以及靶向NRF2治疗DCM的效果进行综述。

1 铁死亡及其机制

细胞死亡是机体维持正常生命活动的重要基础,根据其形态、生物化学和调节特征可分为细胞凋亡、坏死性凋亡、自噬、细胞焦亡、坏死和铁死亡,从某种程度上讲细胞死亡是机体预防疾病的关键因素。DIXON等[1]于2012年首次将这种铁依赖性非凋亡形式的细胞死亡定义为铁死亡。形态学上,铁死亡主要表现为线粒体收缩、线粒体膜密度增加以及线粒体嵴减少或消失。另外,质膜完整性丧失、细胞质肿胀和中度染色质浓缩也是其显著的形态特征[10-11],而其生物化学特征为胱氨酸的缺乏、谷胱甘肽(glutathione,GSH)的消耗和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的失活[12]。这一过程主要与铁代谢途径、脂质代谢途径和Xc-GSH-GPX4途径的调节有关。

1.1 铁代谢途径

铁是生物体必不可少的微量元素之一。脂质过氧化通过铁依赖酶促(非血红蛋白的含铁脂氧合酶家族)和非酶促过程(铁催化的脂质自由基自氧化链式反应,铁驱动的过氧化氢产物的氧化裂解)介导[13]。胞外Fe3+的摄取需要通过转铁蛋白(transferrin,TF)和转铁蛋白受体(transferrin receptor,TFR)的介导来实现。携带Fe3+的TF与靶细胞上TFR结合,利用前列腺六跨膜上皮抗原3将Fe3+还原为Fe2+并进入胞内。TF与TFR表达影响细胞对铁死亡的敏感性,TF消耗和TFR抑制可明显抑制铁死亡水平[14]。细胞内已还原的Fe2+可用于组成铁依赖性酶,或者储存在不稳定铁池和铁蛋白中[15],冗余的Fe2+在膜铁转运蛋白1作用下被转运到细胞外。铁蛋白耗竭或在其他情况下释放到铁池中的铁增加是铁死亡的必要条件。

通常情况下,细胞内铁稳态平衡反映在铁的吸收、输出、利用和储存之间的平衡。当细胞内铁超载时,Fe2+容易与过氧化脂质发生芬顿反应,产生羟自由基,并引起剧烈氧化应激反应,产生大量活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)并诱发铁死亡[16]。同时,Fe2+可增强各种代谢酶活性,促进脂质ROS产生,引起铁死亡。总之,铁是铁死亡必需元素,铁代谢失衡是铁死亡必要过程。

1.2 脂质代谢途径

ROS主要由线粒体产生,在细胞信号转导和维持组织内稳态中起重要作用[17]。ROS生成和清除之间的不平衡可导致与氧化应激相关的各种病理表现,而脂质正是被ROS攻击的最脆弱生物分子之一[18]。因此,脂质过氧化水平代表了氧化应激状态。脂质过氧化为氧自由基、过氧自由基和羟基自由基等自由基攻击多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)二烯丙基的过程,导致脂质过氧化自由基和过氧化氢积累[13]。脂质代谢组学分析表明,PUFA是在铁死亡过程中最容易氧化的脂质,且受磷脂酰胆碱转移酶3、长链脂肪酰辅酶A合成酶4 和acyl-CoA合成酶3种合酶的调节[19]。DIXON等[20]研究发现,参与PUFA合成的长链脂肪酰辅酶A合成酶4和磷脂酰胆碱转移酶3通过将大量突变插入单倍体细胞而在铁死亡过程中扮演重要角色。脂氧合酶也被证实可介导铁死亡过程[19]。另有一些研究证明,敲除或者抑制上述3种合酶可以抑制铁死亡的发生与发展[21-22]。

SHAH等[23]研究发现,脂质自氧化可能是铁死亡的主要原因。有研究发现,位于内质网的细胞色素P450氧化还原酶(cytochrome P450 oxidoreductase,POR)在细胞色素b5还原酶(cytochrome b5 reductase,CYB5R1)的参与下,可促进磷脂过氧化并导致细胞膜损伤[24-25]。尽管存在抗氧化系统,但在CYB5R1的作用下,磷脂氢过氧化物(phospholipid hydroperoxide,PLOOH)仍可能达到作用阈值,这一证据反映了酶促反应在铁死亡中的重要性[23]。此外,抗氧化剂Ferrostatin-1、Liproxstatin-1和维生素E已被证明可通过保护细胞免受脂质过氧化物的影响来抑制铁死亡[13,26]。尽管上述研究证实了脂质过氧化对铁死亡有促进作用,但目前对于脂质过氧化诱导铁死亡的机制和过氧化酶在铁死亡中发挥的其他作用仍有待探索。

1.3 Xc-GSH-GPX4途径

目前普遍认为,铁死亡本质是各种氧化应激刺激所诱导的脂质氢过氧化物铁依赖性积累,而Xc-GSH-GPX4 途径在其中发挥着重要作用。Xc系统是由2个独立蛋白质组成的胱氨酸/谷氨酸逆向转运系统。这2个蛋白质为溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 members 11,SLC7A11)和溶质载体家族3成员2(solute carrier family 3 member 2,SLC3A2)。Xc系统以11比例在细胞内外交换谷氨酸和胱氨酸[27]。转运到细胞中的胱氨酸被还原为半胱氨酸用于合成GSH。GSH是GPX4必需的辅助因子。GPX4已被确定为铁死亡决定性上游调节物质,广泛存在于细胞质、细胞核、线粒体和其他细胞器中[28-29]。GPX4催化脂质氢过氧化物与还原型GSH的巯基结合,将有害物质转化为无毒的脂质醇,从而阻断ROS链反应,避免铁死亡的发生[28,30]。Xc系统摄取胱氨酸这一步骤为半胱氨酸合成限速步骤,阻断或抑制该步骤可导致细胞内半胱氨酸减少,抑制GPX4脂质修复功能,并降低细胞抗氧化能力,从而促进铁死亡[31]。

2 铁死亡与DCM

2.1 DCM概述

DCM为糖尿病患者在无冠状动脉粥样硬化和高血压情况下发生心室功能障碍的临床症状[32]。DCM初始阶段通常无任何症状,随着病情发展会出现呼吸困难、头晕、心律不齐、心绞痛等症状,并且DCM与1型糖尿病和2型糖尿病均密切相关[33]。DCM早期通常表现为心肌纤维化、左心室肥大和舒张功能障碍。在晚期,DCM表现为收缩功能障碍、射血分数降低,最终出现临床心力衰竭[34]。DCM发生发展与一系列复杂调节因素和信号通路有关,包括高血糖、胰岛素抵抗、线粒体功能障碍、内皮功能障碍、微血管功能障碍、ROS积累、内质网应激、心脏自主神经病变、细胞内钙处理受损等[35-36],但氧化应激被广泛认为是导致DCM的主要机制,其为ROS产生和抗氧化能力之间失衡的结果。这些病理改变可能导致细胞死亡,进而导致心肌质量下降、心脏功能受损、间质纤维化和心力衰竭[37]。特异性靶向氧化应激源或内源性抗氧化防御系统可能为DCM有效治疗开辟出新思路。

2.2 DCM中的铁死亡

DCM是一种独立、特定的糖尿病心脏并发症。有证据表明,DCM发生发展过程中存在铁死亡典型特征[38],这表明DCM与铁死亡之间存在联系。一项链脲佐菌素诱导的1型糖尿病大鼠心脏缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤和培养的H9C2心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/re-oxygenation,H/R)损伤实验结果显示,心肌细胞I/R、H/R损伤均会诱导铁死亡,而在抑制铁死亡后2种损伤得到明显改善[38]。另外,内质网应激加重铁沉积是铁死亡的主要诱因之一,也是其典型特征。细胞内铁沉积可不同程度导致包括线粒体结构异常、线粒体ROS爆发、线粒体过氧化脂质积累和线粒体膜电位变化在内的线粒体损伤,这是细胞铁死亡的典型特征[39],ZOU等[40]在DCM大鼠心肌细胞中观察到了铁沉积。WANG等[41]研究发现,相较于非糖尿病小鼠,糖尿病小鼠心脏线粒体表现异常,其线粒体嵴不明显且线粒体膜电位明显下降,这是典型铁死亡导致线粒体异常的特征。此外,糖尿病小鼠心脏线粒体中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和GPX1表达下调,且ROS水平明显升高。在高血糖的情况下,氧化应激和抗氧化系统损伤已被证明是DCM的发病基础[42]。从上述证据可以推测,铁死亡可能通过铁超载致使线粒体损伤,进而破坏抗氧化系统并参与DCM发病机制。

总之,铁死亡与DCM发病机制密不可分,但目前对于DCM中铁死亡机制仍知之甚少,未来仍需要进行相关研究来证实其机制。

3 靶向NRF2治疗DCM

最近“铁死亡标志”被提出,包括GPX4功能丧失、游离铁利用率增加和PUFA氧化[43]。许多负责阻止这些标志物启动铁死亡反应的氧化还原与铁代谢蛋白,如轻链铁蛋白与重链铁蛋白、谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节和催化亚基,包括GPX4,都是NRF2的靶基因[44]。通过靶向药物治疗DCM可能是未来新的研究方向。基于现有的研究成果,现对NRF2的分子机制及其对DCM的治疗机制进行概述。

3.1 NRF2对抗DCM心脏损伤的分子机制

NRF2是氧化应激反应主要调控因子之一,由NFE2L2基因编码,属于碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bZip)转录因子的Cap“n”亚家族,其功能分布广泛,控制着超过1 000个基因的表达,所控制的基因可分为以下几类:抗氧化基因、Ⅱ期解毒酶、转录因子、蛋白酶体、清道夫受体、自噬性降解和新陈代谢基因[45]。作为一种重要的抗氧化应激转录因子,NRF2在提高细胞对氧化应激耐受性方面扮演重要角色。在DCM中,NRF2表达受LAZ3(BCL-6)基因和微RNA-21的调控。LAZ3编码一个包含6个锌指生物基因序列的序列特异性转录抑制因子,其与多个转录因子具有氨基末端同源性[46]。微RNA-21是一种在所有类型糖尿病和心脏疾病中都受到调控的重要遗传物质[47-50]。GAO等[46]研究评估了LAZ3在DCM中的作用,结果发现,LAZ3可通过降低微RNA-21水平来缓解DCM患者的心脏损伤,这一保护作用可被NRF2 siRNA消除。由此推测,LAZ3对DCM的调节作用可能是由微RNA-21和NRF2介导。作为调控抗氧化作用关键因子,NRF2修饰可显著影响心脏和血管的表型。NRF2基因缺失可导致小鼠心脏肥大、左心室舒张功能障碍以及对β-肾上腺素的刺激反应减弱,NRF2缺失还可导致小鼠全身血压降低、主动脉和心脏中内皮型一氧化氮合酶上调,此外,NRF2缺失导致的小鼠左心室功能障碍可能与心肌中肌浆网Ca+-ATP酶下调有关[51]。

NRF2/Keap1/ARE通路是心肌抵抗高糖和糖尿病条件下氧化损伤的主要机制[52]。该信号通路调节许多与抗氧化应激和细胞死亡相关基因;已有研究证明,它们可以减轻氧化应激诱导的心肌损伤并减缓DCM进展[53]。正常稳态下,位于细胞质中的NRF2与其抑制剂Keap1结合,并被Keap1/Cul3依赖性泛素连接酶降解,从而抑制NRF2信号通路;在受到亲电化学物质和氧化应激等外部攻击后,NRF2从Keap1释放并转运至细胞核中,与基因启动子上ARE结合,进而导致包括谷氨酸-半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽-S-转移酶、血红素加氧酶1、过氧化氢酶、NADPH、SOD和醌氧化还原酶等抗氧化酶转录激活,以此拮抗氧化应激引起的组织炎症与损伤[54]。

3.2 靶向NRF2通路改善DCM

大量化学物质被发现可以缓解DCM相关症状。热休克转录因子1(heat shock transcription factor 1,HSF1)是一种应激诱导的转录因子,因调节各种热休克蛋白的转录激活而在热休克反应中为人熟知。有研究报道,HSF1可能通过调节铁代谢相关基因和GPX4的表达,来改善棕榈酸诱导的心肌细胞铁死亡[55]。细胞中辅酶Q10参与铁死亡调节,主要通过抑制细胞膜的脂质过氧化,来减少铁死亡[56]。辅酶Q10可缓解糖尿病引起的心脏舒张功能障碍、心脏纤维化、心肌细胞肥大并修复糖尿病引起的心脏损伤[57]。维生素E作为铁死亡抑制剂,可通过抑制脂质过氧化来改善抗氧化防御系统,缓解糖尿病引起的心力衰竭[58]。

NRF2功能广泛,从抗氧化防御到蛋白质质量控制和代谢,被认为是抗氧化防御主要调节因子;其控制许多与铁死亡相关基因的表达,通常被认为对铁死亡有抑制作用,已成为治疗DCM等与氧化应激相关疾病的潜在药物靶点[59]。萝卜硫素能通过AMPK/AKT/GSK3β信号通路激活NRF2,以上调其下游金属硫蛋白,从而逆转氧化损伤和纤维化[60]。WANG等[61]研究发现,外源精胺可通过抑制NRF2-ROS-p53-MuRF1轴表达来上调钙敏感受体水平,最终恢复钙稳态并缓解氧化应激,从而发挥对1型糖尿病大鼠心脏的保护作用。依帕列净、成纤维细胞因子-21、别嘌呤醇、木犀草素、人沉默调节蛋白6、三七皂苷R1、脂联素等[62]已被证明具有类似作用。尽管如此,这些化合物是否通过阻断糖尿病心肌细胞中的铁死亡来发挥保护作用还有待进一步研究。

3.3 NRF2激活剂治疗DCM的潜在挑战

NRF2已被证明可以参与许多对细胞存活十分重要的信号通路之间的转导[63]。包括萝卜硫素在内的许多NRF2激活剂可以与半胱氨酸反应,调节多种细胞内信号通路转导[64]。新型口服NRF2激活剂Bardoxolone因对患有2型糖尿病的终末期肾病患者产生严重不良反应而退出Ⅲ期临床试验[65],与Bardoxolone相关的药物不良反应正是由于NRF2激活剂脱靶所致。糖尿病和癌症是在全球范围内的常见疾病,流行病学证据表明,糖尿病患者患多种癌症的潜在风险明显高于健康人[66]。目前尚无明确数据证明使用NRF2激活剂会增加癌症发生率,但是癌症患者长期使用NRF2激活剂可能会导致肿瘤转移并恶化预后[67]。

4 结论

铁死亡是一种涉及多种疾病的新型调节性细胞死亡,因其在细胞生长中的重要性和在疾病防治中的作用,在世界范围内引起研究热潮。铁死亡在糖尿病及其并发症,尤其是DCM中发挥重要作用,靶向铁死亡的药物可能为DCM患者提供新的治疗策略。NRF2在其中扮演不可或缺的角色,NRF2药理活性激活有助于对抗DCM的许多病理过程,虽然仍存在一些挑战,但通过靶向药物调控NRF2信号转导未来可能为DCM患者带来福音。