CA-NHEJ系统对大肠杆菌链霉素耐药基因rpsL的编辑效率及其耐药性研究

谢钰珍 覃鸿妮 吴凡 胡杨晓然 薛高旭 赵雪 张勇

摘要：以控制质粒拷贝数的pcnB基因与链霉素耐药性rpsL基因为靶标基因，研究CA-NHEJ系统对大肠杆菌的基因编辑效率，及rpsL相关基因与链霉素耐药性的关系。通过CA-NHEJ系统成功实现了对大肠杆菌MG1655的pcnB和rpsL基因编辑，其中，pcnB基因编辑效率达100%，rpsL基因仅有1个克隆缺失第22～24位3个氨基酸，其他4个克隆未编辑成功但具有链霉素抗性；进一步利用CA-HR系统敲除大肠杆菌MG1655的rpsL基因CCTGCGCTG序列（第22～24位氨基酸），编辑效率达100%，验证了CA-HR的高效性，抗性鉴定表明，该序列是影响链霉素抗性的关键序列，是一个未曾报道的新突变；对于未编辑成功但具有链霉素抗性的4个克隆进行基因测序及比对，找出了rhsC和gadB等6个可能与链霉素抗性相关的其他基因。

关键词：CA-NHEJ系统；CA-HR系统；rpsL基因；耐药性

中图分类号：S188  文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）23-0017-05

CRISPR/Cas9系统因其具有精确识别及特异剪切DNA序列的功能而被开发成为一种高效的基因编辑技术［1-2］。CRISPER系统中的Cas9核酸酶可由sgRNA根据碱基配对定向到任何靶基因组位点，并刺激位点特异性双链DNA断裂（DBS），断裂的DNA链可通过非同源末端连接（NHEJ）和同源性末端连接（HR）2种机制进行修复［3］。其中，NHEJ不仅不依赖于同源臂的设计与合成，而且能实现外源DNA片段随机整合到不同的染色体位点，在基因编辑中显示出显著的优势［4-6］。在真核生物中普遍存在非同源末端连接系统，而大部分的原核生物（如大肠杆菌）缺乏NHEJ修复［7］，仅能通过同源重组（HR）和外源引入的人工设计供体DNA来实现基因敲除，编辑不同基因除了构建CRISPR位点外，还需要构建相应的DNA修復模板，操作繁琐，极大限制了该技术应用于基因组规模的基因编辑。现有学者借鉴真核CRISPR-Cas9基因编辑策略，将CRISPR-Cas9介导的DSB与NHEJ引发的易错DSB修复结合起来，在大肠杆菌中开发了一种新型的不依赖于DNA修复模板的基因突变技术CA-NHEJ（CRISPR-Cas9 assisted Non-Homologous  End Joining），该技术的应用还在进一步探索当中［8］。

本研究以控制质粒拷贝数的基因pcnB和链霉素耐药性相关基因rpsL为靶标，研究 CA-NHEJ系统对2个基因的编辑效率。同时，采用CA-HR系统编辑rpsL基因，并对编辑后菌株的链霉素耐药性进行研究，以期为CA-NHEJ系统在大肠杆菌中的应用提供参考，同时为细菌耐药性研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料与地点

MG1655菌株购于ATCC公司，所有质粒由苏州金唯智生物科技有限公司构建；试验用到的抗性平板、缓冲液、测序引物、TaqDNA聚合酶、大肠感受态等均由苏州金唯智生物科技有限公司生产。试验于2021年在苏州金唯智生物科技有限公司开展。

1.2 试验方法

1.2.1 sgRNA设计

利用http：//www.rgenome.net/网站设计sgRNA引物，“PAM Type”使用默认选项“spCas9 from Streptococcus pyogenes：5′-NGG-3′”，“Target Genome”选择“Others”，“Genomes”选择“Escherichia coli（K-12，MG1655）”，“Target Sequence”下文本框中输入DNA序列，“crRNA length”默认“20”，设计结果出来后，选择“Out-of-frame-Score”，得出分值最高的sgRNA序列（表1）。

1.2.2 质粒制备

本研究采用CRISPR-Cas9介导的DSB与NHEJ引发的易错DSB修复结合（CA-NHEJ）的系统对pcnB、rpsL基因进行基因编辑。构建表达载体pCas9-Mno-Ku+Mfo-ligD质粒（kan抗性）和靶向目的基因载体sgRNA-NHEJ质粒（Spe抗性），后续采用CRISPR-Cas系统结合CA-HR系统对rpsL基因进行基因编辑，构建表达载体pCas9-Red质粒（Kan抗性）和靶向目的基因载体pTarget质粒（Spe抗性）。4个质粒结构（图1）均交由苏州金唯智生物科技有限公司构建，将酶切测序验证正确的目的质粒菌液取回制备质粒。

1.2.3 CA-NHEJ系统对大肠杆菌基因编辑

将pCas9-Mno-Ku+Mfo-ligD质粒电转至大肠杆菌电转感受态细胞MG1655中，复苏1 h后将菌液离心全涂布至Kan抗性的LB平板，将平板放置烘箱30 ℃培养24 h；挑单克隆并制备相应的电转感受态细胞pMG1655；将sgRNA-NHEJ质粒电转置感受态细胞pMG1655中，复苏1 h后将菌液离心涂布至含Kan+Spe抗性的LB平板，30 ℃培养24 h；从Kan+Spe抗性的LB平板上挑取8～24个单克隆至含200 μL LB的96孔深孔板，将96孔深孔板置于30 ℃摇床培养16 h；通过菌落PCR及Sanger测序鉴定基因编辑情况。

1.2.4 CA-HR系统对大肠杆菌基因编辑

将pCas9-Red质粒电转至大肠杆菌电转感受态细胞MG1655中，复苏1 h后将菌液离心全涂布至Kan抗性的LB平板，将平板放置烘箱30 ℃培养24 h；将pTarget质粒电转置感受态细胞pMG1655中，复苏 1 h 后将菌液离心涂布至含Kan+Spe抗性的LB平板，30 ℃培养24 h；从Kan+Spe抗性的LB平板上挑取8～24个单克隆至含200 μL LB 96孔深孔板，于30 ℃培养16～24 h；通过菌落PCR及Sanger测序鉴定基因编辑情况。

2 结果与分析

2.1 CA-NHEJ系统对pcnB基因的编辑

使用pCas9-Mno-Ku+Mfo-ligD和sgRNA-pcnB-NHEJ质粒，通过CA-NHEJ系统对大肠杆菌pcnB基因进行基因编辑，电转涂布含Kan、Sep抗性平板。从生长良好的平板上挑取16个单克隆，以pcnB-F和pcnB-R为引物进行菌落PCR鉴定结果，由图2可知，所有克隆均显示条带，条带大小不一表明基因序列缺失的大小具有随机性。将PCR产物进行Sanger测序，测序结果显示所有克隆的pcnB均发生基因编辑，其中，15个克隆在Cas9切割位点附近发生不同长度的序列缺失，1个克隆（clone-3）在切割位点附近发生序列缺失，同时插入27 bp序列（ACTGGAAAATGTGCAGCCAAACTCGGC），基因编辑效率达100%，表明CA-NHEJ系统对大肠杆菌pcnB基因编辑效率高。

2.2 CA-NHEJ系统对rpsL基因的编辑

使用pCas9-Mno-Ku+Mfo-ligD和sgRNA-rpsL-NHEJ质粒，通过CA-NHEJ系统对大肠杆菌rpsL基因进行基因编辑，电转化后涂布含卡那霉素、壮观霉素、链霉素LB平板，烘箱过夜培养最终平板形成5个单克隆。从平板挑取这5个单克隆，以rpsL-F和rpsL-R为引物进行菌落PCR鉴定，由图3可知，所有克隆皆显示大小一致的条带，将PCR产物进行Sanger测序，测序结果显示仅有1个克隆的rpsL基因成功编辑，在Cas9切割位点附近发生 9 bp 序列（CCTGCGCTG）缺失导致rpsL蛋白缺失第22～24位氨基酸，即Pro（脯氨酸）、Ala（丙氨酸）、Leu（亮氨酸）3个氨基酸，但序列缺失未引起基因的移码突变；另外4个克隆的rpsL基因未发生编辑，为何没未被编辑的4个克隆具有抗性，后续进一步做测序分析（见“2.4”节）。这里的编辑效率低可能是一种假象，因为rpsL基因为大肠杆菌必需基因，基因编辑导致缺失的片段具有随机性，编辑成功的克隆大部分致死。

2.3 CA-HR系统敲除MG1655大腸杆菌rpsL后的抗性分析

使用pCas9-Red和pTarget-rpsL质粒，通过CA-HR系统敲除MG1655大肠杆菌rpsL基因CCTGCGCTG序列（第22～24位氨基酸），涂布卡那霉素、壮观霉素LB平板，平板克隆形态正常。从平板挑取24个单克隆，以rpsL-F和rpsL-R为引物进行菌落PCR鉴定，由图4可知，所有克隆均显示大小一致的条带，进一步将PCR产物进行Sanger测序，测序结果显示所有克隆rpsL的第22～24位氨基酸序列发生缺失，验证了CA-HR系统的编辑效率高，而且由于编辑位置固定，不致死。

将rpsL基因编辑成功的菌液及野生型MG1655菌液分别涂布含链霉素抗性平板，于37 ℃培养 18 h，次日检查，由图5可知，涂布rpsL基因编辑菌液的平板正常形成菌落，涂布野生型MG1655菌液的平板没有形成菌落，表明大肠杆菌rpsL缺失第 22～24位3个氨基酸会产生链霉素抗性。

2.4 rpsL未编辑的克隆全基因组测序分析

为探究4个rpsL基因未编辑的克隆耐受链霉素抗性的原因，通过二代（Hiseq）和三代（Pacbio）高通量测序平台，将1个编辑成功的克隆和4个未编辑成功的克隆及野生型MG1655大肠杆菌进行全基因组测序，将测序结果与NCBI公布的MG1655基因组序列进行比对，分析序列差异，考虑到转座子等可移动元件基因和链霉素抗性关联度较低，部分RNA基因有序列缺失，但是缺失序列较短，本研究优先探究编码蛋白基因和链霉素抗性的相关性，由测序结果（表2）可知，与NCBI公布的MG1655参考序列比对发现，野生型MG1655部分编码蛋白基因（folD等）发生突变，由于野生型MG1655菌株没有链霉素抗性，因此推测这些基因和链霉素抗性关联性极低；MG1655（rpsLΔ22～24）大肠杆菌rpsL基因有 9 bp 序列缺失，与Sanger测序结果一致；rhsC、gadB、ydfK、pinQ、tfaQ、gadA基因在野生型MG1655菌株均未发生突变，但它们中的1个或多个基因在其他有链霉素康抗性的菌株中发生了突变，推测这些基因中可能存在与链霉素抗性有关的基因。

3 讨论

链霉素是一种广谱氨基糖苷类抗生素，通过提高核糖体和非同源tRNA亲和力、干扰核糖体矫正功能，导致细菌蛋白翻译错误率水平提升［9］，细菌有缺陷的突变蛋白的积累会导致细菌死亡，达到杀菌效果［10］。此外，链霉素还会引起氨酰-tRNA从核糖体解离，影响蛋白翻译。rpsL基因编码核糖体蛋白S12，该蛋白对维持翻译水平的精确性有着极为重要的作用，已经有报道表明rpsL基因第43位氨基酸或第88位氨基酸发生突变会产生链霉素抗性，进一步研究发现rpsL更多的突变位点会导致链霉素抗性，这些突变分散在2个区域：第40～43位氨基酸和第87～93位氨基酸［11-13］。本研究使用 pCas9-Mno-Ku+Mfo-ligD和sgRNA-rpsL-NHEJ质粒，通过CA-NHEJ系统对大肠杆菌rpsL基因进行基因编辑，发现1个未有报道的新突变，rpsL缺失CCTGCGCTG（第21～23位氨基酸），即Pro（脯氨酸）、Ala（丙氨酸）、Leu（亮氨酸）3个氨基酸，该突变类型能够产生链霉素抗性。同时，通过对rpsL未编辑但有抗性的4个克隆进行测序和比对，发现了6个可能与链霉素抗性相关的其他基因（rhsC、gadB、ydfK、pinQ、tfaQ、gadA），其作用机理有待进一步研究。

4 结论

通过CA-NHEJ系统成功实现了对大肠杆菌MG1655的pcnB和rpsL的基因编辑，其中，pcnB基因编辑效率达100%，rpsL基因仅有1个克隆rpsL缺失第22～24位3 个氨基酸，其他4个克隆未编辑成功但具有链霉素抗性，编辑效率低可能是因为rpsL基因为必需基因，随机缺失导致大部分编辑成功的克隆致死；进一步利用CA-HR系统敲除大肠杆菌MG1655的rpsL基因CCTGCGCTG序列（第 22～24位氨基酸），编辑效率达100%，验证了CA-HR的高效性，抗性鉴定结果表明该序列是影响链霉素抗性的关键序列；对于未编辑成功但具有链霉素抗性的4个克隆进行基因测序及比对，找出了rhsC和gadB等6个可能与链霉素抗性相关的其他基因，本研究对链霉素抗性机理，核糖体参与的蛋白翻译机制提供新的研究思路。

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