神经内分泌肿瘤相关生物指标应用的研究进展

罗海静 综述,赵颖海 审校

(广东医科大学病理系,广东 湛江 524023)

神经内分泌肿瘤(NENs)是一类起源于肽能神经元和神经内分泌细胞,具有神经内分泌分化并表达神经内分泌标志物的少见异质性肿瘤。NENs在人体分布极为广泛,可发生于纯内分泌器官(垂体前叶、甲状旁腺、甲状腺和肾上腺)、纯神经结构(脊柱旁交感神经链、副交感神经节)和具有弥漫性神经内分泌细胞系统的全身多器官(如皮肤、上呼吸道、肺、乳腺、消化、泌尿和生殖器官系统)[1-2]。本文针对NENs的流行现状、最新世界卫生组织(WHO)分类,以及重要的生物标志物等研究热点进行综述,旨在为NENs的临床规范化诊疗及预后预测提供新进展和新思路。

1 NENs的流行现状

近40年来全球各地区NENs的发病率呈持续上升趋势[3]。DASARI 等[4]于2017年发表在JAMA上的一篇开创性文章中指出,NENs的发病率已从1973年的每10万人中的1.09上升到2012年的每10万人中的6.98,在近40年内增幅达540%。NENs其中以肺及消化系统NENs最为常见,据SEER数据库(美国癌症统计流行病学数据库,监测、流行病学和最终结果数据库)显示,胃肠胰腺部位NENs的发病率高达3.56/10万人。不少国内外的研究报告指出消化系统NENs在不同器官部位的发生率呈现明显差异,一项关于中国胃肠胰腺NENs的回顾性流行病学研究[5],基于中国23家单位在2001-2010年的统计发现,消化系统NENs最常见的发病部位是胰腺(31.5%)和直肠(29.6%),其次是胃贲门(11.6%)和胃体(15.4%)。小肠和结肠NENs在所有患者中所占的比例相对较小。

2 NENs的WHO分类现状

2022年WHO内分泌和NENs分类,以在特定解剖部位的遗传学证据及临床、流行病学、组织学和预后方面的差异作为支持,将上皮NENs分为高分化NENs和低分化神经内分泌癌(NECs)[6]。

不同解剖部位的NENs有不同的分类框架。以消化系统和肺为例证,胃肠胰腺NENs基于核分裂象数和(或)Ki-67增殖指数评估的增殖的分级系统严格划分为G1、G2、G3级,而NECs通常拥有更高的有丝分裂数和(或)Ki-67标记指数,并根据肿瘤细胞形态分类为小细胞NECs、大细胞NECs[7]。在肺NENs中,根据有丝分裂数和(或)Ki-67标记指数和(或)是否存在坏死,分化良好的肺NENs进一步被分级为G1和G2(目前定义为“典型类癌”和“非典型类癌”),低分化的肺NECs分为肺小细胞神经内分泌癌(SCNEC)和肺大细胞神经内分泌癌(LCNEC)[6]。

混合神经内分泌-非神经内分泌肿瘤(miNEN)的组织学方面是异质的,并且根据神经内分泌和非神经内分泌成分的各种可能组合而有所不同[8]。神经内分泌成分的分化程度差异比较大,可以高分化,也可以低分化,其中低分化的神经内分泌成分由NEC(SCNEC或LCNEC亚型)表示;非神经内分泌成分的形态特征因部位而异,通常反映在相关原发部位的癌中观察到的特征,其中腺癌和鳞状细胞癌是最常见的亚型。

3 应用免疫组织化学指导精准诊断、预测预后、个体化治疗方面的作用

由于NEN的高度异质性,且预后依赖于肿瘤等级,NENs的精准诊断变得愈加重要,同时需要更多的生物标志物来改善患者的预后分类和管理。对于病理工作者,可以使用NSE、Syn、CgA、CD56、胰岛素瘤相关蛋白1(INSM1)、生长抑素受体(SSTRs)等免疫组织化学检测来明确神经内分泌分化;p53、视网膜母细胞瘤蛋白1(Rb1)、死亡结构域相关蛋白(DAXX)、α地中海贫血伴智力低下综合征X连锁(ATRX)等免疫组织化学检测对分化良好的NENs-G3或分化差的NECs有重要鉴别意义。此外,结合使用生物标志物和成像方法可以协助诊断、评估治疗的适当性和对治疗的反应[1]。

近年来,各种靶向药物不断涌现,个体化治疗也不断出现,如肿瘤表达SSTR2A,患者应用生长抑素类似物(SSAs)长效奥曲肽或兰瑞肽可获益;甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)的免疫组织化学表达或启动子甲基化状态能预测肿瘤对替莫唑胺肿瘤的敏感性。因此,未来纳入基因组和表观遗传生物标志物的前瞻性研究是有必要的,并具有个体化治疗和监测策略的转化潜力。

3.1INSM1 INSM1是一种常见的锌指转录因子,具有独特的组织特异性表达模式,其表达仅限于正常的胚胎神经内分泌组织,包括发育中的前脑、后脑、嗅觉上皮、视网膜、小脑、胰腺、胸腺、甲状腺、肾上腺和胃肠道的内分泌细胞,在正常成人组织和大多数非NENs中不表达。编码蛋白识别特定的DNA靶序列,并下调与神经内分泌细胞分化相关的多个靶基因的表达,对神经内分泌系统的发育起重要调控作用,在早期胰腺内分泌、交感肾上腺谱系及泛神经源前体发育中起着关键作用。此外,INSM1通过激活Shh、PI3K/AKT、MEK/ERK1/2、ADK、p53、cyclin D1、β-catenin、LSD1和N-myc发挥额外的核活性,助长了NENs的发生[9]。

NENs细胞通常对神经内分泌分化标志物具有弥漫性和强烈的免疫反应。INSM1在NENs中高水平再表达,已经作为一种新型的NENs免疫标志物进入研究专家的视野。近年来的研究表明,商品化的抗-INSM1单抗能够在多种组织起源的NENs中表达,其敏感性和特异性优于现有的神经内分泌标志物[10-11]。在大多数NENs中,特别是在小细胞肺癌(SCLC)中,已证明INSM1比其他神经内分泌标志物更敏感,更具有特异性[12]。因此,INSM1可以作为NENs鉴别诊断中有意义的辅助手段。

由于INSM1严格的组织特异性,并在NENs中高表达,其调节区域被认为是靶向治疗设计的潜在候选对象[13]。尽管人们普遍认为,在试图实现有效的肿瘤抑制时,直接靶向转录因子相对困难,但最近的研究表明,在INSM1表达的背景下靶向INSM1相关信号通路的新型策略是有效的[14]。此外,将针对NENs的自杀基因或报道基因与INSM1启动子融合可用于NENs的有效诊断和治疗[9]。基于对INSM1作为NENs特异性生物标志物及其下游信号通路的理解,INSM1可能成为未来设计新型癌症治疗策略的一大领域。

近年来,有研究发现肺外神经内分泌癌(EPNEC)具有独特的神经内分泌谱系特异性转录谱,且INSM1的基因表达降低与侵袭性疾病的特征和较短的总生存期相关[15]。低INSM1基因表达在EPNEC中是一种新的潜在不利预后标志物,INSM1在高级别NEC中的潜在预后作用值得在更大的独立系列中进行验证。

3.2SSTRs SSTRs属于G蛋白偶联受体(GPCR)家族,由5种不同亚型的G蛋白偶联跨膜受体(SSTR1～5)组成,并作为生长抑素的靶受体发挥生理功能。因此,SSTRs在介导生长抑素的生物学活性和功能方面起关键作用。

SSTRs有很多亚型,其中SSTR2已经成为诊断和治疗NENs的重要靶点[16-17]。另外,由于SSAs和放射性核素的快速发展,基于SSTRs的生长抑素受体成像和肽受体放射性核素治疗(PRRT)改变了NENs的传统诊断和管理范式。有研究发现,68Ga-DOTATATE-PET/CT可准确诊断肺类癌,但原发部位和转移灶SSTRs表达程度有差异,提示肿瘤高度的异质性[18]。此外,68Ga-DOTATATE-PET/CT在表达SSTRs的胃肠胰腺NENs患者的定位、分期和管理上有重要作用[19]。

近年来,SSAs已被广泛用于胃肠胰腺NENs的治疗。然而,因为结合的受体结合位点更丰富,SSTR2拮抗剂(如JR11)在诊治NENs上被报道为较SSTR2激动剂(如奥曲肽)更有效[20]。肽受体PRRT为代表的肿瘤靶向放射治疗也成为NENs治疗的新热点[21]。然而,这些疗法的基本要求是肿瘤的SSTRs有足够高的表达。SSTRs的免疫组织化学可以在组织上常规进行,可以为NENs的常规诊断和预测提供快速且具有成本效益的方法。

据报道,依赖人眼或采用数字图像分析(DIA)评估SSTR2免疫反应性可以作为预测新型PRRT效果的方法[22]。此外,SSTRs功能成像,例如使用68Ga-DOTATOC-PET/CT图像扫描,经常在分期和随访中发现CT或MRI忽略的额外病变,并提供患者是否适合使用未标记或放射性标记的SSAs进行治疗的信息[23]。还有研究表明,18F-FDG和68Ga-DOTATATE双示踪显像可以更好地表征肿瘤的异质性,有助于选择受益于治疗的PRRT候选人,并评估预后[24]。总而言之,结合使用SSTRs和核医学可以协助诊断、评估治疗的适当性和疗效。

3.3ATRX/DAXX DAXX是一种高度特异性的组蛋白伴侣蛋白,选择性引导组蛋白H3.3沉积在臂间和端粒异染色质上[25]。ATRX是SWI/SNF家族中的染色质重塑三磷酸腺苷酶。这2种肿瘤抑制基因编码的相关蛋白可以形成复合物,并与组蛋白H3.3结合沉积在特定区域,如端粒和着丝粒,并参与凋亡和染色质重塑,对维持体细胞基因组的完整性和稳定性有重要意义。

依赖于核分裂象数和(或)Ki-67增殖指数评估的WHO分级提供了与NENs分期无关的重要预后信息[8]。然而,有丝分裂指数和Ki-67测定都容易受到采样问题、解释错误的影响,并且可能不能真实反映这些肿瘤的临床行为。越来越多的证据表明G3 PanNENs和PanNECs是截然不同的肿瘤,在病因、遗传学、治疗和预后上都有所不同,但在缺乏G1或G2成分的情况下两者在形态上难以区分[26]。因此,对于这种临界病例,推荐使用DAXX/ATRX 免疫组织化学法来协助区分和评估。在胰腺NENs中,ATRX、DAXX的缺失通常用于支持G3 PanNENs的诊断;反之则诊断为PanNECs[8]。

ATRX和DAXX相互作用形成染色质重塑复合物,它们的丢失导致端粒延长(ALT)和染色体不稳定(CIN)。最近有研究发现,ALT的存在能够独立预测较短的无复发生存期,并与直径小于或等于2.0 cm无功能PanNENs较低的总生存率相关,而当替代ALT或联合ALT时,ATRX/DAXX免疫标记的丢失也观察到类似的结果[27]。与此一致的是,印度的一项分析PanNENs中ATRX/DAXX改变的研究表明,ATRX/DAXX表达缺失是发病机制的晚期事件,与侵袭性表型相关[28]。基于DAXX或ATRX基因改变可以直接通过免疫组织化学检测到,DAXX和ATRX免疫组织化学分析可以替代ALT状态评估所需劳动强度更高的荧光原位杂交(FISH)技术,纳入到PanNENs的预后评估项目中,特别是对于无功能PanNENs[8]。

3.4Rb/p53 Rb、p53蛋白均属于肿瘤抑制因子,在细胞转化和肿瘤抑制中具有重要作用。Rb具有独特的细胞谱系特异性作用,对调节神经内分泌细胞命运至关重要。p53基因分为野生型和突变型2种,其中野生型p53蛋白极不稳定,并具有反式激活功能和广谱的肿瘤抑制作用。Rb、p53基因的缺失或突变已被证实是许多肿瘤发生的原因之一,两者相互调节,对SCLC的发生发展起重要作用[29]。

分化良好的NENs通常没有TP53和Rb1基因突变,包括具有高增殖率的NENs-G3;因此,肿瘤细胞未检测到p53蛋白的表达,保留Rb蛋白的表达。相比之下,低分化NENs经常在p53和Rb1基因中出现突变,表现为核Rb表达缺失和p53过表达[7-8]。与DAXX和ATRX免疫标记只适用于胰腺NENs不同,使用p53和Rb蛋白作为低分化NENs的标记对所有位点都是有效的。因此,推荐使用Rb、p53免疫组织化学检测协助鉴别诊断NENs-G3和NECs[8]。

NENs的最新分类已将NENs-G3定义为与低分化NECs不同的实体[8]。另外,既往很多研究都发现NENs-G3、LCNEC和SCNEC患者对EP(足叶乙苷、顺铂)化疗的预后和反应不同,2个Ki-67增殖指数均大于55%但组织学特征不同的肿瘤对铂基化疗的反应存在差异,这些都提示PanNENs-G3患者的治疗选择和分层仍有待完善。

一项日本关于胰腺NENs-G3的多中心、回顾性研究发现,2种不同类别NENs-G3和NECs-G3对铂类化疗(EP)的反应存在显著差异,且Rb缺失与胰腺NENs-G3患者对铂类药物的治疗反应相关[30]。另一项关于大细胞NECs分子亚型预测化疗结果的回顾性研究进一步明确Rb1突变状态和Rb1/p16蛋白表达是化疗反应的预测标志物,可能有助于指导晚期LCNEC疾病的治疗决策[31]。因此,通过下一代测序(NGS)进行的Rb和p53基因突变分析可以在使用的扩展癌症基因组中进行,Rb和p53的免疫组织化学可以取代昂贵的基因检测,有效地用于筛选,为病理学家提供有用的诊断提示,并为临床医生提供治疗指导方向。

3.5MGMT MGMT是一种高效的DNA直接修复酶,能修复DNA序列中的O6-甲基鸟嘌呤损伤,是人类细胞中迄今发现的唯一一种修复该损伤的甲基转移酶。MGMT对基因组的稳定性至关重要,如果MGMT异常,不能发挥正常的作用或作用不足,将导致DNA中G∶C配对转换为A∶T配对,就会导致癌基因的激活和抑癌基因失活,进一步发展引起肿瘤。

不可切除的NENs通常对标准治疗方法反应不佳。在一些临床试验中,替莫唑胺在晚期或转移性、侵袭性和低分化NENs的治疗中获得了令人鼓舞的结果[25]。2022年版中国抗癌协会NENs诊治指南中指出,对Ki-67增殖指数低于55%的G3级NENs患者,推荐替莫唑胺为主的化疗方案,而对Ki-67增殖指数大于或等于55%的G3级NENs,可参考NECs的化疗方案[1]。由于NENs的高度生物异质性,建立预测替莫唑胺治疗反应的生物标志物对于避免不必要的治疗至关重要。

替莫唑胺是一种烷化剂,能使DNA鸟嘌呤O6位发生烷基化而产生抗肿瘤活性,从而导致DNA错配和肿瘤细胞死亡。在胶质母细胞瘤中,对替莫唑胺反应的预测是基于MGMT基因甲基化状态的评估,因为MGMT高表达会抵消烷化剂的治疗效果,从而导致化疗耐药[32]。因此,可以尝试通过检测MGMT状态来评估替莫唑胺的活性和疗效。有不少研究发现,甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)可能是一种用于评估MGMT基因甲基化很有前景的技术,进而预测NENs中对替莫唑胺的反应,这需要更多的前瞻性临床试验来进行验证[33]。

一项通过免疫组织化学检测MGMT和错配修复系统(MMR)蛋白在一系列PanNENs中的表达实验研究发现,MGMT低表达PanNENs多见于病理分级高、Ki-67指数高和无功能肿瘤,这提示MGMT的表达降低与胰腺NENs进展的高风险相关;同时,该研究还观察到,PanNENs低表达MGMT的患者比PanNENs高表达MGMT的患者无复发生存期更短[34]。因此,未来MGMT的表达可能被认为是了解PanNENs生物学行为的一种标记。

4 小 结

目前可用于NENs诊断与鉴别诊断、指导治疗及预后评估的生物标志物丰富多样,包括INSM1、SSTRs、ATRX、DAXX、Rb、p53、MGMT等,不同器官部位NENs的分子表达谱具有重要的临床研究价值,要将对NENs分子认识的快速进展转化为诊断、预后或预测标记,仍有许多工作要做。值得注意的是,在不久的将来,随着分子检测手段的发展,关键分子在组织样本中的免疫组织化学应用将为NENs诊断中的细胞生物学和治疗问题的评估提供有价值且有经济收益的信息。