流体切应力对铜绿微囊藻细胞活性的影响

刘任静,蒋文涛*,徐凯仁,李忠友,李 潇,闵 磊,梁 英

流体切应力对铜绿微囊藻细胞活性的影响

刘任静1,2,3,蒋文涛1,2,3*,徐凯仁1,2,3,李忠友1,2,李 潇1,2,闵 磊1,2,梁 英1

(1.四川大学建筑与环境学院,四川 成都 610065；2.四川大学,生物力学工程四川省重点实验室,四川 成都 610065；3.宜宾四川大学产业技术研究院,四川 宜宾 644000)

为讨论流体切应力对铜绿微囊藻细胞活性的影响,本文研究了铜绿微囊藻在0.0,0.3,0.6,0.9Pa切应力作用下的生长情况,并分析了藻细胞生理指标以及藻液指标的变化情况.结果显示,低于0.6Pa的切应力能使藻细胞密度和光合色素含量不断增加,从而促进铜绿微囊藻的生长繁殖.其中0.6Pa对藻细胞生长最有利,此条件既能提高藻细胞光合作用强度和营养盐利用率,又未过度破坏细胞结构.但0.9Pa高切应力将通过对藻细胞结构的破坏来影响膜渗透性,进而抑制铜绿微囊藻生长与代谢.研究表明,流体切应力对铜绿微囊藻细胞的影响体现为“低促高抑”,即适度切应力能够增强铜绿微囊藻细胞的活性,而高切应力会抑制其生长.本文结果将为湖泊水库等水体铜绿微囊藻水华的预防和治理提供了新的思路和方案.

水华；切应力；铜绿微囊藻；光合作用；细胞膜

水体富营养化导致的蓝藻水华是世界性水环境问题[1].我国有三分之一湖泊处于富营养化状态,其中太湖,巢湖,滇池仍为国家湖泊水华治理的重点[2].蓝藻水华会消耗水中溶解氧并破坏水生生态系统平衡,还会产生剧毒藻毒素威胁饮用水安全,给社会和经济的可持续发展带来了不利影响[3-4].

水华的形成受环境因素和藻细胞生理结构的制约,其中环境因素包括水体营养盐浓度,光照和水动力条件等[5-6].在环境因素中,水体营养盐浓度的控制所需周期长,难度大而光照等气候条件又难以实现人为调控,故探究水力扰动对藻类生长的影响已成为水华治理的重点[7].已有大量研究证实流动,流速和扰动等水力学条件对藻类生长具有显著影响[8-10],适度的水体扰动能促进微囊藻的生长和菌落数的增加[11-13].然而,无论是哪种水力扰动,其本质都是水体中动力学环境的变化,即流体压强或切应力的改变[14].研究发现蓝藻在0.4MPa静压即水下40m处压强才会被破坏,而蓝藻水华多发生在水下5m和浅水湖泊中,由此可见切应力是影响藻类生长的主要因素[15].

围绕切应力对藻类生长影响,已有研究发现螺旋藻和小球藻在相同剪切流中产氧率变化完全相反,表明不同种类的微藻对切应力响应与耐受力存在不同规律,这与Thomas等通过总结量化得出微藻对切应力的敏感程度为绿藻<蓝藻<硅藻<甲藻的结论相符[16-17].此外,研究还发现流体切应力会改变真核细胞和原核细胞长度和形态,且长时间切应力作用能够增加微藻产氧量[18-19].由此可见,微藻生长过程的确会受切应力影响.但近年来国内外针对切应力与藻细胞关系的研究主要集中于工业生产中需要大量繁殖的微藻种类,以获得不同培养仪器中藻细胞达到高生长率的条件[20-21],而关于切应力对典型水华藻种生长影响的研究尚未得到足够的关注.

因此本研究选取水华优势藻种铜绿微囊藻为研究对象,将切应力作为唯一影响参数,通过对不同切应力状态下铜绿微囊藻细胞生长情况和藻细胞内部生理指标变化以及藻细胞培养液(藻液)指标变化来探究切应力对铜绿微囊藻生长特性和活性的影响,从而为揭示富营养化水体中蓝藻水华爆发原因及其预防和治理提供参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料与装置

铜绿微囊藻水华是最常见蓝藻水华之一,BG11培养基为常用微藻培养基,因此选取铜绿微囊藻FACHB-905为实验对象,BG11为实验培养基[22-23],两者均购自中科院水生生物研究所淡水藻种库.

图1 剪切流旋转桶装置与双桶示意

实验装置为剪切流旋转桶装置,如图1所示,双桶为透明亚克力材质,外桶固定于地面,内桶由电机带动旋转,变频器用于控制旋转桶的速度,取样口距外桶底部1cm.此装置可产生稳定且均匀切应力场[24],桶间切应力表达式见式(1)[16]

式中:为剪切应力,Pa;为培养基动力粘性系数, Pa·s;为旋转桶角速度(rad/s);1,2分别为旋转桶内,外半径;为旋转桶内某质点距旋转轴的距离(1££2).其中:1=140mm,2=150mm,壁厚均为5mm,即的范围为140～145mm.将实验仓中心位置即=142.5mm处的切应力代表藻细胞所受切应力,此时切应力的变化不超过1.8%.

1.2 实验方法

将购置的藻种与培养基1:2在无菌室内接种后置于光照培养箱中,按照中科院水生生物研究所的方法扩大培养后用于实验.实验开始时,向旋转桶装置中加入铜绿微囊藻悬浮液800mL,设置光照强度为 3500lx,室内平均温度为28℃,藻液从培养箱中取出后静置2h,以确保藻液的温度与室温一致,光暗比为 14:10,转速分别为0,100,200,300r/min,其对应切应力约0.0,0.3,0.6,0.9Pa,将4种条件实验组分别定义为静止组和低,中,高切应力组.实验周期为7d,每2d取样15mL,用于测定其藻液指标和藻细胞指标.在装置停止后1min内完成取样,以保证取样的均匀性和实验的连续性.藻液指标包括pH值,营养盐浓度(总氮浓度TN,总磷浓度TP)和核酸含量;藻细胞指标包括铜绿微囊藻密度,藻细胞增长率(藻比增长率),叶绿素a浓度(Chl-a),类胡萝卜素浓度(car),藻蓝蛋白浓度(PC),别藻蓝蛋白浓度(APC)和丙二醛浓度(MDA).

1.3 分析测试方法

采用pH值,TNTP浓度和藻液核酸含量表征藻液指标的变化.其中,藻液pH值使用pH计(PHS-3C)进行测量;TNTP浓度使用总磷测定仪(5B-6P)和总氮测定仪(LH-3BN)进行测量;藻液核酸含量采用分光光度法即用260nm处吸光度来评估藻细胞渗出的核酸浓度[25].

采用藻密度和藻比增长率,Chl-a和car浓度,PC和APC浓度,MDA含量表征藻细胞指标变化.其中,铜绿微囊藻密度采用分光光度法即680nm处吸光度来代表藻细胞密度[26]; Chl-a和car浓度测定采用甲醇提取的紫外分光光度法[27-28]:取5mL藻液离心(4°C, 13500r/min, 5min),弃去上清液后将藻细胞重悬于5mL甲醇(90%)中,60°C水浴10min后再次离心,收集上清液并使用紫外可见分光光度计(UV- 4802)测量在 470,652,665nm处的吸光度并计算;PC, APC浓度按照孙晓筠等[29]的方法进行测量;MDA含量采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定.藻比增长率计算如下:

式中:X为当天细胞密度;X-1为前1d细胞密度;t为X对应培养时间;t-1为X-1对应培养时间.

数据处理和图像绘制使用Origin 2023,对照组和实验组密度,叶绿素a浓度等指标差异采用IBM SPSS Statistics 26单因素方差法(<0.05)进行统计分析.

2 结果与分析

2.1 流体切应力对铜绿微囊藻细胞培养液的影响

实验开始时,各组藻液TN,TP,pH值无显著性差异(图2) (>0.05),随着实验进行 TN有不同程度降低(图2a):静止组和低,中切应力组表现为切应力越大,TN越小;而高切应力组对TN的利用率仅高于静止组,到试验结束时其各组TN分别下降13.6%, 24.3%,28.2%和16%.实验各组TP在第5d才出现显著性差异(图2b) (<0.05),其中静止组和低,中切应力组变化趋势相同,而高切应力组的TP剩余量在实验结束时仍高于其余组.实验中,虽然各组藻液TN, TP不断下降,但营养盐浓度始终处于富营养化水平,足以维持藻细胞的正常生长.静止组和低,中切应力组在实验开始后pH值不断增加(图2c),而高切应力组的pH值在实验第3d下降后才上升,但直至实验结束其pH值仍低于其余组.

2.2 流体切应力对铜绿微囊藻细胞密度和光合色素的影响

通过铜绿微囊藻密度(图3a)表征其总生物量,藻比增长率(图3b)表征其增长速率.实验开始后各组密度呈现出上升趋势(图3a),藻密度从第3d开始出现了明显的区别,总体表现为切应力组密度高于静止组但中,高切应力组生长曲线无明显差异(>0.05).从比增长率来讲,各组都呈现先上升后下降的趋势,且最大比增长率出现在中切应力组(图3b).

*代表<0.05;**代表<0.01

铜绿微囊藻细胞中的光合色素分为脂溶性色素(Chl-a,car)和水溶性蛋白(PC,APC),光能在藻胆体中传递的顺序为PC-APC-Chl-a[30].实验前各组铜绿微囊藻细胞的光合色素含量差异不显著(图4)(> 0.05).藻细胞的Chl-a,car浓度随实验时间的增加而增加(图4a,图4b),到实验第5d后,静止组和低,中切应力组Chl-a,car浓度存在显著性差异(<0.05),实验结束时切应力越大,Chl-a,car浓度越高.藻细胞PC,APC相对含量呈现先下降后上升的趋势(图4c,图4d),到实验结束时PC相对含量表现为切应力组高于静止组,而APC相对含量在实验第3d后呈现出随切应力增加而增加并且随着实验时间的增加而增加的规律.

2.3 流体切应力对铜绿微囊藻细胞膜的影响

各组铜绿微囊藻藻液的核酸含量随着实验进行呈现出先下降后上升趋势(图5a),实验进行中静止组藻液核酸含量基本维持原来水平,而切应力组核酸含量随切应力的增加而增加,且处理时间越长,核酸含量越高.实验第3d切应力组藻液核酸含量无明显差异(>0.05),但静止组与切应力组之间存在明显差异(<0.05).实验第5d后各组差异显著(< 0.05).MDA含量变化与核酸含量变化相似,静止组MDA含量从第3d开始基本保持不变,而切应力组 MDA含量随切应力的增加而上升且随着处理时间的增长而增加(图5b).

图5 铜绿微囊藻细胞膜指标

*代表<0.05;**代表<0.01

3 讨论

微囊藻水华是最常见的水华藻属,研究证明水动力扰动对微囊藻生长有直接影响[22].本文以切应力为水动力扰动参数,在光照强度,营养盐浓度等环境因素保持一致的前提下,利用剪切流旋转桶装置对铜绿微囊藻细胞施加不同强度切应力(0,0.3,0.6, 0.9Pa)来探究藻细胞在切应力作用下生长变化情况,为揭示流体力学应力对铜绿微囊藻水华的影响提供理论依据.

结果显示,藻细胞在经过短暂适应期后便迅速繁殖进入对数增长期,流体切应力对铜绿微囊藻生长有显著影响,小于0.6Pa的切应力组较静止组表现为促生长作用.究其原因,首先在实验中光合色素含量均较静止组显著上升,而脂溶性色素Chl-a,水溶性蛋白PC,APC含量的增加能强化藻细胞对光能的捕获,吸收与传递,car又能起到防止叶绿素分子被破坏,维持光合机能的运作[31],两个方面共同作用进而增强光合作用促进藻细胞生长.其次,实验设置的光照强度为3500lx,小于铜绿微囊藻的光饱和点40000lx[32].当光照强度低于光饱和点时,切应力可通过改变藻细胞的光照机制来增强细胞的分裂过程[33-34],这可能是切应力通过光合作用促进藻细胞生长的另一种方式.故切应力条件可以从两个不同的角度促进藻细胞光合作用的进行,这是出现促进作用的原因之一.

从另外一方面来看,在0～0.6Pa范围内,藻细胞对TN,TP吸收利用率随切应力的增加而增加,这一实验结果与其他研究中切应力能提高营养盐传递速率的结果一致[35],铜绿微囊藻需要这些外源性氮来维持生长代谢及产毒,并利用水体中的外源性磷来用于胞内核酸,ATP和细胞膜上磷脂等生理组织的合成及生理代谢[36-37].因此,切应力条件还能通过提高营养物质吸收利用率来促进藻细胞的生长.

最后,铜绿微囊藻是一种自养型生物,二氧化碳是其主要碳源,而切应力造成的水体流动混合既可使水中二氧化碳梯度随着水体混合强度的增高(即切应力的增大)而减小[38],促进藻细胞对二氧化碳的吸收;又可降低藻细胞周围分泌和代谢产物浓度,减少其对藻细胞生长的抑制作用,进而提高藻细胞的生长速率[39].

但是在高切应力组(>0.9Pa),并未出现与低/中切应力组一致的生长情况.因为已有研究证实藻细胞受损后会释放大量胞内酸性物质和内源性营养物质[40],同时降低藻细胞对营养盐的利用率[35],因此核酸外渗量和MDA的累积量可用于表征藻细胞损伤水平和细胞膜脂质过氧化的程度[41].高切应力组结果显示这两个指标含量与切应力成正相关且在高切应力条件下显著增大,表明高切应力会导致细胞膜遭受不可逆损伤而抑制藻细胞的生长代谢.其他学者的研究也表明铜绿微囊藻在高混合培养环境中所积累的MDA是铜绿微囊藻生长减慢的原因[42-44].此外,高切应力组pH值和营养盐(TN,TP)的变化规律与藻细胞损伤后的结果规律也一致,进一步证实藻细胞在高切应力作用下将产生不可逆损伤.

综上所述,切应力在较低范围内(本文<0.6Pa)能通过改善藻细胞光照机制和提高二氧化碳利用率来增强光合作用,通过均衡营养盐分布来促进总磷,总氮吸收,适当的水体流动混合还能降低藻细胞周围代谢物浓度,最终起到促进藻细胞生长的作用.而在高切应力(本文>0.9Pa)条件下,切应力将对藻细胞的结构产生破坏,影响细胞膜渗透性和生理功能,进而抑制藻细胞生长.由此趋势可判断,切应力的持续增加将进一步对藻细胞膜产生更严重的损伤,会更显著的抑制藻细胞生长甚至直接导致藻细胞的机械破碎,这与已有的高速流动和强水力扰动对水华具有抑制和消亡作用等研究结果相吻合[8,45].事实上流体切应力对细胞的影响在很多领域均已被证实:医学研究发现低的壁面切应力(<0.6Pa)对内皮细胞的作用是发生动脉粥样硬化的重要原因[46-47];植物学研究也表明,高剪切力会使得植物细胞生长率,产量和细胞聚集体的大小都有所下降,当切应力高达100Pa时,会直接使植物细胞分散[48-49];微生物学研究也同样发现在10.9～14.5Pa高切应力下大肠杆菌细胞会发生长度变化和不对称分裂[19].以上证据表明切应力是一个影响动植物和微生物细胞生长的重要因素.由此可见,已有的水力扰动研究中无论是最佳转速,最佳水力强度还是最佳生长流速等均是在一定切应力作用下产生的结果.

需要注意的是,本文的结果是在平均温度28℃,光强3500lx,光暗比为14:10且营养盐充分等有利于铜绿微囊藻生长的条件下获得的,而在湖泊水库中水华的休眠与复苏与其水质气候等环境因素紧密相关[50-51].因此,若要将切应力对藻细胞的影响规律应用到治理水华实例中,还应考虑其所处环境条件“因地制宜”.以温度为例,低温(15℃)比适宜温度(25℃)对藻类带来的抑制作用会更为显著[52],即在相对低温的环境下,所需的可产生抑制效果的临界切应力可能会更小,反之,酷暑高温环境下,所需的临界切应力可能会更大.因此,还需要根据不同湖泊富营养化程度和温度变化情况等环境因素综合考虑后分析切应力的最优抑制效果.同样也提示,不同水质,温度和富营养等条件下切应力对藻细胞的影响规律还需要更加深入的研究.

4 结语

本文以铜绿微囊藻为研究对象,在光照和温度等外部环境因素保持一致的前提下,对藻细胞施加不同强度的均匀切应力,旨在探究流体切应力对铜绿微囊藻细胞生长的影响.结果清晰的展示了铜绿微囊藻在不同切应力作用下生长变化情况,验证了流体切应力是影响藻细胞活性的直接因素,获得了实验室条件下铜绿微囊藻细胞对切应力的耐受范围,同时发现切应力对铜绿微囊藻细胞的影响体现为“低促高抑”,即低切应力能提高藻细胞活性而高切应力会抑制藻细胞生长与代谢.

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Effect of fluid shear stress on activity ofcells.

LIU Ren-jing1,2,3, JIANG Wen-tao1,2,3*, XU Kai-ren1,2,3, LI Zhong-you1,2, LI Xiao1,2, MIN Lei1,2, LIANG Ying1

(1.College of Architecture and Environment, Sichuan University, Chengdu 610065, China；2.Key Laboratory for Biomechanical Engineering of Sichuan University, Chengdu 610065, China；3.Yibin Industrial Technology Research Institute of Sichuan University, Yibin 644000, China)., 2023,43(2)：896～903

To study the effect of the shear stress on the cell activity of, its growth under shear stresses, 0.0, 0.3, 0.6 and 0.9 Pa, was investigated accordingly, and the changes of the algal-cell physiological indicator and the algal-fluid indicator were analyzed. The results indicated that the shear stress below 0.6 Pa can cause the density and photosynthetic pigment content of Microcystis aeruginosa cells increase, promoting their growth and reproduction.The photosynthetic intensity and the nutrient utilization were enhanced by the most favorable shear-stress condition (0.6Pa) for growth, while the cell structure was not excessively damaged. However, the high shear stress, 0.9Pa, would affect the membrane permeability of the algal cells by breaking their structure, thereby inhibiting their growth and metabolism.The results demonstrated that the growth ofcells was affected by the fluid shear stress, manifested as “low promotion and high inhibition”, where their activity was enhanced by moderate shear stress, and their growth was inhibited by the high shear stress. The findings provided a hint or an approach for preventing and managingblooms in water bodies, such as lakes and reservoirs.

water bloom；shear stress；Microcystis aeruginosa；photosynthesis；cell membrane

X172

A

1000-6923(2023)02-0896-08

刘任静(1998–),女,四川乐山人,四川大学建筑与环境学院环境系硕士研究生,主要从事湖泊富营养化水体研究.

2022-07-18

国家自然科学基金资助项目(11972239;12102281),四川省自然科学基金(2022NSFSC1967)

* 责任作者, 教授, scubme_jwt@outlook.com