靶向Nrf2/ARE通路治疗缺血性卒中的研究进展

杨晓菲，李 强*，李延峰，王洪权

1.赤峰学院附属医院 神经内科, 内蒙古自治区 赤峰 024000； 2.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 神经科, 北京 100050；3.航天中心医院/北京大学航天临床医学院 神经内科, 北京 100049

缺血性卒中(ischemic stroke,IS) 是世界范围内死亡和长期致残的主要原因之一，治疗方法有限，因此研发治疗药物具有重要意义。NF-E2相关因子2(Nrf2)通过协调多种细胞保护基因表达，是机体防御氧化应激损伤的主要调节因子[1]。近年研究显示，通过药物激活NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)/抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)通路可抑制氧化应激损伤、小胶质细胞激活和神经炎性反应等机制来抑制缺血性卒中神经元丢失，发挥对脑保护作用。因此，靶向调控Nrf2/ARE通路成为治疗缺血性卒中很有吸引力的新靶点。本文目的主要综述近2年来在短暂局灶性脑缺血(transient focal cerebral ischemia, tMCAO)动物模型中通过药物激活Nrf2/ARE通路治疗脑缺血损伤研究的最新进展。

1 Nrf2/ARE通路

缺血性卒中存在Nrf2/ARE通路的激活。在生理条件下，Nrf2主要定位于细胞质内， 与Nrf2上游调控因子Keap1结合，经泛素蛋白酶途径降解，从而使Nrf2维持在基础水平。当细胞在脑缺血期间受到过多的氧化刺激时，Nrf2与Keap1分离、转运到细胞核，与抗氧化和细胞保护蛋白的ARE序列结合并激活这些保护基因，后者包括血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1), NAD(P) H:醌氧化还原酶1(NAD(P)H quinone oxidoreductase，NQO1), 谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx), 和谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase, GST)家族等一些成员。

2 Nrf2/ARE通路激活在短暂局灶性脑缺血中的作用

通过短暂结扎阻塞大脑中动脉(middle cerebral artery occlusion, MCAO)造成的局灶性脑缺血/再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)的动物模型，称之为短暂局灶性脑缺血(tMCAO)模型。研究显示，在tMCAO模型中Nrf2/ARE通路被激活。I/R导致如过氧化氢(H2O2)等在内的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高，后者反过来激活Nrf2，转运到细胞核的Nrf2与细胞保护基因的抗氧化反应原件(antioxidant response element, ARE)结合，进而上调包括HO-1在内的抗氧化蛋白，从而可减轻I/R期间过量产生的ROS所引起的氧化应激损伤和细胞死亡。

在tMCAO后24 h脑损伤最严重，因此大多数研究在该时间点检测脑组织Nrf2/ARE通路改变，包括皮层、大脑半球、海马、纹状体和小脑在内不同缺血脑组织中Nrf2的变化。而有些研究延伸到早期(2～8 h)或晚期(3～14 d)。多数研究者选择持续1～2 h的脑缺血制备tMCAO I/R动物模型。大多数研究在持续1～2 h造成tMCAO后24 h检测缺血皮层或大脑中的总Nrf2水平，显示Nrf2在mRNA和蛋白质水平均上调(可高达2～3倍)。Nrf2蛋白水在8 h后开始升高[2]，可持续3～14 d。核转位后Nrf2在细胞核内聚集，增加与ARE结合的活性[3]，这一现象可出现在tMCAO后7 h[4]。而Nrf2靶基因，包括HO-1和NQO1等也同时上调。HO-1升高可持续2～14 d。tMCAO后24 h，缺血侧海马神经元总Nrf2蛋白和细胞核内Nrf2蛋白表达明显升高，并至少持续升高2 d。另有免疫组化研究显示，1 h缺血造成tMCAO后再灌注2 h后在缺血区域周围存在Nrf2升高，8 h后达峰，而包括HO-1在内的Nrf2靶基因在24～72 h后明显升高。

1 h缺血造成tMCAO后7 d[3]在神经元、内皮细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞中存在Nrf2免疫阳性[5]。利用荧光素酶小鼠模型观察到从脑缺血开始到tMCAO后7 d存在时间依赖性Nrf2表达。在缺血早期未检测到体内Nrf2表达的荧光信号，但在缺血后24 h达到峰值。这种Nrf2表达主要在缺血半暗带区检测到，主要定位于神经元和星形胶质细胞内部[6]。通过量化绿色荧光蛋白(GFP)标记的Nrf2，发现缺血后4～48 h的皮质和24 h的纹状体中Nrf2和HO-1 蛋白增高更加明显。

3 药物靶向激活Nrf2/ARE通路抑制缺血性脑损伤

在脑缺血中靶向激活Nrf2/ARE通路触发细胞保护反应，能够抑制缺血性脑损伤，使Nrf2激活剂成为治疗实验性短暂局灶性脑缺血的可能性。以下本文综述近2年来通过激活Nrf2/ARE通路在tMCAO实验模型中治疗脑缺血损伤的研究进展。

3.1 黄酮类化合物

槲皮素(quercetin)通过SIRT1/Nrf2/HO-1信号通路显著降低脑梗死体积、神经功能缺损、血脑屏障(blood brain barrier,BBB)通透性和ROS生成。此外，选择性Sirt1抑制剂EX527逆转了这种神经保护作用，表明槲皮素通过SIRT1信号通路保护MCAO大鼠的BBB，从而对脑缺血再灌注损伤具有抑制作用[7]。花葵素(pelargonidin)为常见的花青素(anthocyanidin)之一，最近研究显示，其可通过激活Nrf2通路，上调HO-1、SOD，下调肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白细胞介素-6 (IL-6)和丙二醛(MDA)，进而在tMCAO大鼠模型中降低脑梗死面积、改善神经功能[8]。 枇杷苷(eriocitrin)在tMCAO大鼠模型中，可通过激活Nrf2通路，上调HO-1、SOD和NQO1, 抑制NF-κB p65的磷酸化，降低脑组织内IL-6和TNF-α的水平、增加IL-10的含量，进而通过抗氧化和抗炎作用发挥其对I/R损伤的抑制作用[9]。作为草药主要查尔酮成分的黄腐酚(xanthoangelol, XAG)可通过激活Nrf2抑制氧化应激诱导的凋亡，在tMCAO大鼠模型中发挥抑制神经元损伤的作用[10]。其他黄酮类化合物如山奈酚(kaempferol)[11]、黄芪黄酮(astragalin)[12]和三叶苷(trilobatin)[13]等均可通过激活Nrf2/ARE通路发挥在tMCAO模型中的脑保护作用。综上所述，黄酮类化合物在tMCAO模型中具有激活Nrf2通路，发挥抑制缺血性卒中损伤的作用。

3.2 多酚类化合物

多酚二苯乙烯类天然化合物白皮杉醇(piceatannol)在小鼠I/R中其可激活Nrf2, 上调HO-1和 NQO1发挥改善神经功能评分和减少脑梗死面积，进而具有神经保护和抗脑缺血损伤的作用[14]。 叶下珠素(phyllanthin)在I/R大鼠模型中通过激活Nrf2通路，抗神经炎性反应、氧化应激和抗凋亡机制，从而改善脑功能障碍和脑水肿，抑制脑损伤[15]。绿原酸(chlorogenic acid, CGA)在tMCAO大鼠模型中抑制大脑受损，增强学习能力和改善空间记忆。此外，CGA以剂量依赖性方式促进脑源性神经生长因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)的表达，减轻I/R诱导的神经损伤。此外，CGA增加SOD活性和GSH水平，降低ROS和MDA的生成。值得注意的是，CGA减轻氧化应激诱导的脑损伤和细胞凋亡，并抑制凋亡相关蛋白(caspase-3和caspase-9)的表达。此外，CGA促进Nrf2、NQO-1和HO-1的表达。Nrf2途径抑制剂ML385减弱CGA对脑损伤的抑制作用，表明CGA通过Nrf2通过发挥其抗氧化和凋亡作用[16]。综上所述，多酚类化合物在tMCAO模型中具有激活Nrf2通路，发挥抑制缺血性脑损伤作用。

3.3 中草药提取物

作为中药闭苞买麻藤提取物主要成分的异丹叶大黄素(isorhapontigenin，ISO)治疗显著改善神经功能评分，减少梗死体积、坏死神经元，减少ROS产生、4-羟基壬烯醛加合物(4-HNE)和8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine, 8-OHDG)水平。同时，ISO显著增加Nrf2和HO-1的表达。而敲除Nrf2和HO-1能够抵消ISO的神经保护作用，此外，蛋白激酶Cε(PKCε)基因的敲除阻断了ISO诱导的核Nfr2和HO-1表达，因此，ISO具有抑制脑缺血再灌注损伤作用，其神经保护机制可能与PKCε/Nrf2/HO-1通路有关[17]。补骨脂(psoralea corylifolia)提取物补骨酯酚(bakuchiol, BAK)在tMCAO小鼠模型中，减轻小鼠的神经功能缺损，减少梗死体积、脑水肿和神经元损伤。BAK减少了脑内 Iba1(ionized calcium binding adapter molecule 1)免疫反应细胞的数量，表明小胶质细胞的激活减少。BAK还降低了NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18的表达，BAK促进Nrf2在细胞核内聚集和HO-1水平的升高，表明BAK通过激活Nrf2信号通路、抑制NLRP3介导的炎性反应从而抑制缺血性脑损伤[18]。二分生褐藻提取物氢青石烯二萜 (hydroazulene diterpenes, HDD)在tMCAO大鼠模型中通过激活Nrf2/ARE通路发挥神经保护作用[19]。丁苯酞(L-3-n-butylphthalide, L-NBP)作为治疗急性脑梗死的药物，其可通过激活Nrf2/HIF-1α/VEGF信号通路，改善大脑微循环和促进脑血管新生[20]。 研究首次证明枸杞提取物狼毒甲素(lyciumamide A, LyA)通过激活PKCε/Nrf2/HO-1通路，抑制氧化损伤和神经元凋亡，从而抑制I/R诱导的脑损伤[21]。总之，中草药提取物在tMCAO模型中具有激活Nrf2通路，发挥抑制缺血性脑损伤的作用。

3.4 萜类化合物

羽扇豆醇(lupeol)可显著减少tMCAO大鼠的脑梗死体积和含水量，并恢复神经行为功能，下调氧化应激和炎性因子的表达，激活Nrf2，抑制caspase-3活性，降低BAX/Bcl-2比率，抑制p38 MAPK的磷酸化，总结其可能通过激活Nrf2和抑制细胞凋亡途径来抑制氧化应激和炎性因子生成，从而抑制脑缺血损伤[22]。

综上所述，近2年来研究显示黄酮类化合物、多酚类化合物、中草药提取物和萜类化合物等均具有激活Nrf2/ARE通路的作用，进而在tMCAO实验性动物模型中发挥抗氧化、抗凋亡、抗神经炎性反应等药理学作用，进而发挥它们对缺血性脑损伤的抑制作用。

4 问题与展望

植物源性活性化合物具有抗氧化作用，通过激活Nrf2信号在缺血性卒中实验模型中具有神经保护作用。不同的天然化合物由于其诱导Nrf2激活的能力不同，从而使包括HO-1和NQO1在内的抗氧化酶表达增加以及降低氧化应激标记，从而在实验性tMCAO模型中表现出有益的作用。不同生物活性化合物激活Nrf2调节不同途径，通过活化PI3K/Akt、MAPK和NF-κB等磷酸化激活Nfr2，进而上调保护基因表达，抑制缺血性脑损伤。目前作为Nrf2激活剂之一的多靶点天然化合物在脑缺血中的具体神经保护机制还有待于深入研究。鉴于Nrf2/ARE激动剂丁苯酞和依达拉奉通过激活Nrf2对急性缺血性卒中具有治疗作用，提示探索靶向Nrf2/ARE通路的药物治疗缺血性卒中的临床试验研究值得进一步探索。总之，本文表明，植物源性天然化合物作为Nrf2激活剂，有望成为治疗缺血性卒中新的潜在药物。