总评归一-响应面法优化米槁叶多糖的提取工艺

魏 晴，何兰凤，郑 双，梁珊珊，孙庆文

(1.贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州中医药大学 大果木姜子研究中心，贵州 贵阳 550025；3.贵州中医药大学 植物多糖研究中心，贵州 贵阳 550025)

米槁(CinnamomummigaoH.W.Li)为樟科(Lauraceae)樟属(Cinnamomum)常绿乔木。大果木姜子为米槁的干燥成熟果实，是贵州苗族民间常用药物，最早收录于《本草纲目拾遗》。大果木姜子具有驱散、疏通中焦寒气而止痛的作用，临床常用来治疗因寒邪阻滞而引起的胸腹部疼痛[1]。但大果木姜子产量低、体积小、不易采摘。目前对米槁果实的化学成分和药理学研究比较深入[2-4]，但对米槁其它部位如叶、种子等的研究较少。

多糖与蛋白质功能相似，作为生命活动中不可缺少的大分子，在免疫系统中起着重要的作用[5-9]。传统的多糖提取工艺存在耗时长、溶剂用量大、工艺复杂等缺点，不利于大规模生产。因此，需要开发一种操作简单、高效的多糖提取工艺。由于单一评价指标不足以全面反映多糖提取工艺的优化结果，故选取多个指标综合评价多糖提取工艺[10]。作者以米槁叶为研究对象，以米槁叶得膏率、多糖含量和抗氧化活性为评价指标，在单因素实验的基础上，采用总评归一-响应面法优化米槁叶多糖的提取工艺，为米槁叶的开发应用提供理论基础。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

米槁叶，采摘于贵州省罗甸县，经贵州中医药大学药学院孙庆文教授鉴定为米槁(CinnamomummigaoH.W.Li)的叶。

葡萄糖标准品(纯度>98%，批号MB6951)，大连美仑生物技术有限公司；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，纯度>99%)，美国Sigma公司；苯酚、无水乙醇，分析纯，西陇科学。

UV1100型紫外可见分光光度计，上海赫尔普仪器有限公司；KQ-3200E型超声波清洗仪，青岛精诚仪器仪表有限公司。

1.2 米槁叶的前处理

取新鲜的米槁叶，除去多余的枝梗和杂质，置于室内通风处阴干后，粉碎，过40目筛，得到米槁叶粉末。

1.3 米槁叶多糖提取工艺的优化

以得膏率、多糖含量和抗氧化活性等3个指标对米槁叶多糖提取工艺进行综合评价。采用Hassan法归一化处理得膏率、多糖含量、抗氧化活性这3个指标[11]，所有指标最终通过总评归一值(OD)进行评价。

1.3.1 单因素实验

采用单因素实验，分别考察提取时间(25 min、30 min、35 min、40 min、45 min)、提取功率(40 W、60 W、80 W、100 W、120 W)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，mL∶g，下同)、提取次数(1、2、3、4、5)、提取温度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)对米槁叶得膏率、多糖含量、抗氧化活性的影响。

1.3.2 响应面实验

在单因素实验的基础上，选取提取时间、提取功率、液料比为考察因素，以OD值为评价指标，设计响应面实验，进一步优化米槁叶多糖的提取工艺。

1.4 检测方法

1.4.1 得膏率的测定

参照文献[12-13]方法测定得膏率。将洁净蒸发皿置于105 ℃恒温干燥箱中干燥至恒重(m0)，精密量取提取液10 mL，置于蒸发皿中水浴蒸干，再于105 ℃干燥至恒重，冷却30 min后，迅速精密称重(m)。按式(1)计算得膏率：

(1)

式中：V为提取液体积，mL；W为米槁叶粉末样品质量，g。

1.4.2 多糖含量的测定

参照文献[14-15]方法绘制葡萄糖标准曲线。精密称取葡萄糖标准品10.02 mg，置于105 ℃恒温干燥箱中干燥至恒重，移入50 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容，得到0.20 mg·mL-1的葡萄糖标准母液；然后将标准母液依次稀释得到0.10 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.025 mg·mL-1、0.012 5 mg·mL-1的标准溶液。分别取各浓度标准溶液1 mL，加入6%苯酚溶液1 mL，混匀，再迅速加入5 mL浓硫酸，摇匀后冷却至室温，以1 mL蒸馏水作为空白对照，测定490 nm处吸光度。以葡萄糖浓度(mg·mL-1)为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，拟合得到线性回归方程为：A=8.201c+0.05327，R2=0.9994。

参照文献[16-17]方法测定米槁叶多糖含量。取提取液0.1 mL，加入0.9 mL蒸馏水、1 mL 6%苯酚溶液，摇匀，迅速加入5 mL浓硫酸，摇匀后冷却至室温，测定其吸光度。根据标准曲线回归方程计算提取液中的多糖含量，按式(2)计算多糖含量：

(2)

式中：c为提取液中的多糖含量，mg·mL-1；n为稀释倍数；V为提取液体积，mL；W为米槁叶粉末样品质量，mg。

1.4.3 抗氧化活性的测定

通过测定米槁叶多糖对DPPH自由基的清除率评价其抗氧化活性。参照文献[18]方法，取提取液2 mL，加入2 mL DPPH自由基工作液，摇匀，避光静置30 min，测定517 nm处吸光度，平行测定3次，取平均值。按式(3)计算DPPH自由基清除率：

(3)

式中：A0为DPPH自由基工作液的吸光度；A1为提取液+DPPH自由基工作液的吸光度；A2为提取液的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取时间的影响(表1)

表1 提取时间对米槁叶得膏率、多糖含量和抗氧化活性的影响Tab.1 Effect of extraction time on extraction rate of solid extracts,polysaccharides content,and antioxidant activity of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由表1可知，随着提取时间的延长，得膏率、多糖含量、DPPH自由基清除率均逐渐升高；当提取时间为40 min时，各指标达到最高；当提取时间继续延长至45 min时，各指标略有下降。可能是由于，提取时间过长，米槁叶中其它成分被提取出来，导致多糖占比降低、抗氧化活性下降。因此，提取时间选择40 min较为适宜。

2.1.2 提取功率的影响(表2)

表2 提取功率对米槁叶得膏率、多糖含量和抗氧化活性的影响Tab.2 Effect of extraction power on extraction rate of solid extracts,polysaccharides content,and antioxidant activity of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由表2可知，随着提取功率的增大，得膏率、多糖含量、DPPH自由基清除率均逐渐升高；当提取功率为80 W时，各指标达到最高；当提取功率继续增大至100 W后，各指标略有下降。可能是由于，提取功率过大，多糖结构被破坏，导致多糖含量下降、抗氧化活性降低。因此，提取功率选择80 W较为适宜。

2.1.3 液料比的影响(表3)

表3 液料比对米槁叶得膏率、多糖含量和抗氧化活性的影响Tab.3 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of solid extracts,polysaccharides content,and antioxidant activity of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由表3可知，随着液料比的增大，即提取溶剂用量的增加，得膏率、多糖含量、DPPH自由基清除率均逐渐升高；当液料比为30∶1时，各指标达到最高；当液料比继续增大至40∶1后，各指标略有下降。可能是由于，提取溶剂用量过多，更多其它成分被溶出，导致多糖含量下降、抗氧化活性降低。因此，液料比选择30∶1较为适宜。

2.1.4 提取次数的影响(表4)

表4 提取次数对米槁叶得膏率、多糖含量和抗氧化活性的影响Tab.4 Effect of extraction times on extraction rate of solid extracts,polysaccharides content,and antioxidant activity of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由表4可知，随着提取次数的增加，得膏率略有升高，多糖含量、抗氧化活性先略微升高而后降低，总体变化不大。综合考虑，提取次数选择1次较为适宜。

2.1.5 提取温度的影响(表5)

由表5可知，随着提取温度的升高，得膏率、多糖含量、DPPH自由基清除率均逐渐升高；当提取温度为60 ℃时，各指标达到最高；当提取温度继续升至70 ℃后，各指标均明显下降。因此，提取温度选择60 ℃较为适宜。

表5 提取温度对米槁叶得膏率、多糖含量和抗氧化活性的影响Tab.5 Effect of extraction temperature on extraction rate of solid extracts,polysaccharides content,and antioxidant activity of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

2.2 响应面实验结果

2.2.1 响应面实验设计与结果

响应面实验的因素与水平见表6，设计与结果见表7。

表6 响应面实验的因素与水平Tab.6 Factors and levels of response surface methodologies

表7 响应面实验设计与结果Tab.7 Design and results of response surface methodologies

2.2.2 回归模型的建立与方差分析

对实验结果进行拟合，得到回归方程为：OD值=0.96-0.039A+0.092B+0.086C+(2.350E-003)AB+(6.250E-004)AC-0.11BC-0.26A2-0.24B2-0.46C2。

对回归模型进行方差分析，结果见表8。

表8 方差分析Tab.8 Analysis of variance

由表8可知，模型的P<0.0001，差异有统计学意义；失拟项F=6.02，P=0.0578>0.05，不显著，说明该模型拟合度较好。一次项B、C，二次项BC，交互项A2、B2、C2对OD值的影响极显著。进一步比较F值可知，各因素对米槁叶多糖提取的影响大小顺序为：提取功率(B)>液料比(C)>提取时间(A)。

2.2.3 响应面分析

各因素交互作用对OD值影响的响应面图及等高线图见图1。

由图1可知，提取功率与液料比的响应曲面较陡，且等高线呈椭圆，说明两者交互作用对OD值影响较大，与方差分析结果一致。由方程得到米槁叶多糖的最佳提取工艺为：提取时间39.33 min、提取功率77.30 W、液料比28.67∶1，在此条件下，OD值为0.956 0。

图1 各因素交互作用对OD值影响的响应面图及等高线图Fig.1 Response surface plots and contour plots for interaction between various factors on OD value

2.3 工艺验证

考虑到实际可操作性，将米槁叶多糖的最佳提取工艺调整为：提取时间40 min、提取功率80 W、液料比30∶1。在此条件下进行3次平行验证实验，OD平均值为0.957 1，与预测值(0.956 0)的相对偏差为0.11%，米槁叶多糖含量为3.42%。说明该模型预测性较好，多指标评价优化的米槁叶多糖提取工艺可行。

3 结论

以米槁叶得膏率、多糖含量和抗氧化活性为评价指标，在单因素实验的基础上，采用总评归一-响应面法优化了米槁叶多糖的提取工艺。确定最佳提取工艺为：提取时间40 min、提取功率80 W、液料比30∶1(mL∶g)，在此条件下，OD值为0.957 1，米槁叶多糖含量为3.42%。该研究为开发米槁新的药用部位提供了理论依据。