沙库巴曲缬沙坦治疗肺动脉高压大鼠的效果及其机制研究

李敏琦，谭思远，唐艺金，唐毅，2，郑昭芬，2

肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一种以肺血管重塑和肺动脉压力升高为特征的致命性疾病，可导致右心室肥厚、纤维化，最终发展成右心衰竭甚至导致患者死亡［1］。尽管经过了有效的管理与治疗，PAH患者仍存在症状反复发作、预后欠佳等情况。因此，寻找新型的、能有效治疗PAH的药物具有重要意义。

研究表明，内皮素1通路、前列环素通路和一氧化氮（nitric oxide，NO）/可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）/环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）通路在PAH发生发展过程中具有重要意义［2］，其中，增加cGMP水平的治疗策略是目前已批准的治疗方案之一［3-4］。沙库巴曲缬沙坦是一种由脑啡肽酶抑制剂和1型血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂组成的复合药物，其能通过调控cGMP水平及抑制利钠肽的降解而发挥舒张血管、抗心肌肥厚及纤维化的作用［5-6］。近年来，国外有少量研究表明，沙库巴曲缬沙坦可通过增加体内cGMP水平而舒张小动脉并改善血管重塑，有作为PAH有效治疗方式的潜力［4，6］，但国内尚未见相关报道。本研究旨在探讨沙库巴曲缬沙坦治疗PAH大鼠的效果及其机制，以期为临床PAH的药物治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验时间 本实验时间为2020年6—11月。

1.2 实验大鼠 27只6周龄雄性SD大鼠（体质量160～180 g）购自湖南斯莱克景达实验动物公司，饲养在室内空气（O2浓度为21%）、光照/黑暗12 h交替循环的环境中，使用专用大鼠合成饲料喂养，不限制饮水。本实验经湖南省人民医院医学伦理委员会批准（批准文号：2020-59）。

1.3 主要实验试剂 野百合碱（monocrotaline，MCT）购自美国Sigma-Aldrich公司，抗α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）抗体购自美国Abcam公司，cGMP ELISA试剂盒购自美国开曼公司，心房利钠肽（atrial natriuretic peptide，ANP）ELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 分组与干预方法 适应性喂养1周后将大鼠随机分为对照组、PAH组和沙库巴曲缬沙坦组，各9只。将MCT溶解在1 mol/L的HCl溶液中，并用1 mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.4，以制备MCT溶液；PAH组、沙库巴曲缬沙坦组大鼠单次腹腔注射MCT溶液（60 mg/kg）以构建PAH模型，对照组大鼠单次腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液；从第2天起，对照组、PAH组给予0.5%羟乙基纤维素钠灌胃（3 ml·kg-1·d-1），沙库巴曲缬沙坦组给予沙库巴曲缬沙坦灌胃（将100 mg沙库巴曲缬沙坦溶于5 ml 0.5%羟乙基纤维素钠中）（60 mg·kg-1·d-1），持续给药3周。PAH组中1只大鼠在实验第18天死亡。

1.4.2 血流动力学、右心室重构指标检测 实验结束后腹腔注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）以麻醉大鼠，分离颈部血管，将聚乙烯-50导管经右颈外静脉送入右心室，使用生物信号采集和分析系统（成都泰盟软件有限公司）测量并记录大鼠右心室收缩压（right ventricular systolic pressure，RVSP），共测量3次，取平均值。检测完RVSP后，对所有大鼠进行安乐死，打开大鼠胸腔，立即解剖心脏和肺，将右心室从左心室和室间隔中分离出来，并分别称重，计算右心室肥厚指数（right ventricular hypertrophy，RVH），RVH=右心室重量/（左心室重量+室间隔重量）。

1.4.3 肺血管重构指标检测 使用4 ℃的杜氏磷酸盐缓冲液灌洗大鼠肺后取出肺组织，并用4%多聚甲醛溶液固定，乙醇溶液脱水、石蜡包埋并切片后进行HE染色；收集肺小动脉（直径为30～100 μm）的图像并测量其外径和肺动脉中膜厚度（pulmonary artery media thickness，PAMT），计算肺动脉中膜厚度百分比（percentage of pulmonary artery media thickness，PAMT%），PAMT%=2×PAMT/外径×100%。大鼠肺组织经固定切片后进行抗α-SMA免疫组化染色，使用Image-Pro Plus 6.0版软件（美国Media Cybernetics公司）计算α-SMA积分光密度值，即α-SMA水平。

1.4.4 血浆cGMP、ANP检测 检测完RVSP后，从大鼠的腹主动脉收集全血样本，1 000 r/min离心10 min（离心半径8.6 cm），取血浆保存在-80 ℃冰箱中备用。参照ELISA试剂盒说明书检测各组大鼠血浆cGMP、ANP。

1.5 统计学方法 使用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血流动力学、右心室重构指标 三组大鼠RVSP、RVH比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；PAH组、沙库巴曲缬沙坦组大鼠RVSP、RVH高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；沙库巴曲缬沙坦组大鼠RVSP、RVH低于PAH组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 三组大鼠血流动力学、右心室重构指标比较（±s）Table 1 Comparison of hemodynamic and right ventricular remodeling indexes in the three groups

表1 三组大鼠血流动力学、右心室重构指标比较（±s）Table 1 Comparison of hemodynamic and right ventricular remodeling indexes in the three groups

注：PAH=肺动脉高压，RVSP=右心室收缩压，RVH=右心室肥厚指数；1 mm Hg=0.133 kPa；a表示与对照组比较，P＜0.05；b表示与PAH组比较，P＜0.05

组别 只数 RVSP（mm Hg） RVH对照组 9 28.6±6.6 0.23±0.02 PAH组 8 56.6±10.4a 0.44±0.09a沙库巴曲缬沙坦组 9 40.6±8.4ab 0.34±0.05ab F值 22.967 28.470 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.2 肺血管重构指标 三组大鼠PAMT%、α-SMA比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；PAH组、沙库巴曲缬沙坦组大鼠PAMT%、α-SMA高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；沙库巴曲缬沙坦组大鼠PAMT%、α-SMA低于PAH组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2、图1～2。

图1 三组大鼠肺组织HE染色结果（×20）Figure 1 HE staining results of lung tissue of rats in three groups

图2 三组大鼠肺组织α-SMA免疫组化染色结果（×20）Figure 2 Immunohistochemical staining results of α-SMA in lung tissue of rats in three groups

表2 三组大鼠肺血管重构指标比较（±s）Table 2 Comparison of pulmonary vascular remodeling indexes in the three groups

注：PAMT%=肺动脉中膜厚度百分比，α-SMA=α-平滑肌肌动蛋白；a表示与对照组比较，P＜0.05；b表示与PAH组比较，P＜0.05

组别 只数 PAMT%（%） α-SMA（AU）对照组 9 18.6±2.0 1.19±0.12 PAH组 8 43.7±1.9a 1.62±0.18a沙库巴曲缬沙坦组 9 29.0±2.1ab 1.40±0.07ab F值 340.096 24.472 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 血浆cGMP、ANP 三组大鼠血浆cGMP、ANP比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；PAH组大鼠血浆cGMP低于对照组，血浆ANP高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；沙库巴曲缬沙坦组大鼠血浆cGMP、ANP高于对照组、PAH组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 三组大鼠血浆cGMP、ANP比较（±s）Table 3 Comparison of plasma cGMP and ANP in the three groups

表3 三组大鼠血浆cGMP、ANP比较（±s）Table 3 Comparison of plasma cGMP and ANP in the three groups

注：cGMP=环磷酸鸟苷，ANP=心房利钠肽；a表示与对照组比较，P＜0.05；b表示与PAH组比较，P＜0.05

组别 只数 cGMP（pmol/ml） ANP（pg/ml）对照组 9 0.20±0.04 214.4±79.7 PAH组 8 0.14±0.21a 313.8±110.6a沙库巴曲缬沙坦组 9 0.35±0.09ab 521.3±111.3ab F值 28.191 21.501 P值 ＜0.001 ＜0.001

3 讨论

PAH是严重影响人类健康的疾病，其突出特点是肺血管重塑导致肺血管阻力和肺动脉压升高。在PAH发生发展过程中，肺循环后负荷持续升高可导致右心室肥大、右心室纤维化和右心室功能障碍，最终导致右心衰竭。沙库巴曲缬沙坦是脑啡肽酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂组成的复合药物，可发挥舒张血管、抗心室重构的作用。本研究旨在进一步探讨沙库巴曲缬沙坦对PAH大鼠右心室肥厚、肺血管重构的影响及其潜在机制。

本研究结果显示，PAH组、沙库巴曲缬沙坦组大鼠RVSP高于对照组，提示造模成功；沙库巴曲缬沙坦组大鼠RVSP低于PAH组，提示沙库巴曲缬沙坦可减小PAH大鼠右心室压力。本研究结果还显示，PAH组、沙库巴曲缬沙坦组大鼠RVH高于对照组，沙库巴曲缬沙坦组大鼠RVH低于PAH组，表明沙库巴曲缬沙坦可以减轻PAH大鼠右心室重构。此外，本研究结果还显示，PAH组、沙库巴曲缬沙坦组大鼠PAMT%、α-SMA高于对照组，沙库巴曲缬沙坦组大鼠PAMT%、α-SMA低于PAH组，提示沙库巴曲缬沙坦可以减轻PAH大鼠肺血管重构。ANDERSEN等［6］通过Mikro-Tip导管测量SU5416和缺氧（SU5416 and hypoxia，SuHx）诱导的PAH大鼠的RVSP，并采用体视学方法评估肺血管和右心室组织形态学改变情况，结果显示，沙库巴曲缬沙坦能够降低大鼠RVSP，减轻大鼠肺血管重构及右心室肥厚、扩张，本研究结果与之相似。

舒张血管以降低血管阻力是PAH的重要治疗策略，而cGMP、ANP在血管舒张过程中发挥着重要作用。组织中的NO可激活sGC，而激活后的sGC可促进其底物三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）转化为cGMP并激活蛋白激酶G（protein kinases G，PKG），进而导致平滑肌松弛［7-8］。有研究提示，ANP延缓PAH进展的潜在机制可能是其与自身受体结合后，可使cGMP水平升高，进而促进血管舒张［9］。CLEMENTS等［10］研究显示，沙库巴曲缬沙坦能降低SuHx诱导的PAH大鼠的右心室舒张末期压和肺动脉收缩压，减轻右心室肥厚及纤维化，减轻肺血管重构，增加肺组织中ANP、脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）、cGMP水平。本研究结果显示，PAH组大鼠血浆cGMP水平低于对照组，沙库巴曲缬沙坦组大鼠血浆cGMP水平高于对照组、PAH组，提示沙库巴曲缬沙坦可能通过升高血浆cGMP水平来降低PAH大鼠RVSP、减轻其右心室重构及肺血管重构。本研究结果还显示，PAH组大鼠血浆ANP水平高于对照组，这可能与PAH发病时右心负荷增加导致心肌细胞释放ANP有关；沙库巴曲缬沙坦组大鼠血浆ANP水平高于对照组、PAH组，分析原因为沙库巴曲缬沙坦可抑制脑啡肽酶，从而减少ANP的降解。

综上所述，沙库巴曲缬沙坦可以降低PAH大鼠RVSP，减轻大鼠右心室重构和肺血管重构，其机制可能与上调大鼠血浆cGMP水平有关，这为PAH的临床治疗提供了新思路。但本研究是通过MCT构建PAH大鼠模型的，结果不宜直接套用到其他PAH模型（如SuHx诱导的PAH模型）上，需要在不同方法构建的PAH模型中进一步验证沙库巴曲缬沙坦治疗PAH的效果。

作者贡献：李敏琦进行文章的构思与设计，撰写论文；李敏琦、唐毅进行研究的可行性分析、论文修订；李敏琦、谭思远、唐艺金进行实验实施及统计学处理；郑昭芬负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。