基于丝素蛋白的可注射水凝胶在肌肉再生工程的应用

2023-02-21李艾元施心雨刘梦斐宣智宏岳万福

丝绸 2023年2期

李艾元, 施心雨, 刘梦斐, 李诚, 宣智宏, 岳万福

(浙江农林大学动物科技学院·动物医学院,杭州 311300)

蚕丝作为一种多用途的高分子聚合物,在组织工程和再生医学中的应用得到了广泛的探索[1]。丝素蛋白是从蚕丝提取的纤维蛋白[2]。丝素蛋白由一条重(H)链和一条轻(L)链组成,通过二硫键相连,形成HL复合物[3]。这种HL复合物还通过疏水作用以6︰1的比例结合形成一种糖蛋白(P25),三者构成基本胶束单元[4]。除了丝素蛋白外,蚕丝中还存在丝胶蛋白[5],当蚕结茧时,丝胶蛋白起到胶水的作用,丝胶蛋白将丝素蛋白结合在一起,丝胶蛋白占蚕丝的重量近30%[6]。丝素蛋白是一种生物相容性材料,因为它不会引起长期或持久的炎症反应[7]。当植入人体内时,它会引起轻微的初始炎症反应,并随时间消退,表明丝素蛋白具有免疫相容性,与其他常见生物材料相比,丝素蛋白的免疫原性较低[8]。

湖羊肌肉卫星细胞具备分化成湖羊肌肉组织的能力,与本次实验对象湖羊来自同源,不会引起免疫排斥反应。肌肉损伤和老化是人体肌肉主要的疾病形式[9]。肌肉损伤的修复过程首先需要激活肌肉卫星细胞,因为新肌肉纤维或原发性肌纤维的形成始于肌肉卫星细胞的激活[10]。其次是肌肉卫星细胞的增殖和分化阶段,形成肌细胞。最后通过肌细胞融合形成肌纤维,并整合到现有的肌肉中,完成肌肉的自我修复[11]。尽管肌肉具有与生俱来的再生能力,但某些条件下自我修复最终达不到健康的肌肉组织的标准,反而导致萎缩、发病和功能丧失[12]。例如,严重的车祸和大面积烧伤等意外中,肌肉组织的大量损失会阻碍修复过程并妨碍肌肉的功能恢复[13]。此外,某些肌肉萎缩疾病也可以阻止正常的肌肉组织再生过程[14]。肌肉卫星细胞疗法是增强肌肉修复的一种新的手段,采用自体或同种异体干细胞来增强自身肌肉修复的能力[15]。

组织工程技术尚未生产出用于治疗肌肉损伤的可靠产品,市面上人工合成物质在人体内难以降解并会引发免疫排斥反应,因此丝素蛋白水凝胶逐渐进入人们的视野[16],丝素蛋白水凝胶能够为细胞提供附着点和与细胞发生特异性作用,可调节的物理支撑,连接水凝胶内外的孔隙结构,进行氧气、营养物质和生长因子的交换[17],因此非常适合作为肌肉组织再生的细胞支架[18-19]。利用水凝胶进行肌肉组织工程已成为一种有希望的治疗方案。例如,将丝素蛋白水凝胶用作封装肌肉细胞的递送载体,发现丝素蛋白水凝胶能够促进肌肉细胞的增殖和分化,丝素蛋白水凝胶能够促进肌肉细胞整合,同时保护移植细胞免受移植手术加剧的慢性炎症环境的影响[20]。鉴于丝素蛋白水凝胶的多功能性,丝素蛋白水凝胶构成了独特的生物材料,广泛用于组织工程研究及许多肌肉疾病和损伤病理学[21]。

图1为DMPG诱导的丝素蛋白水凝胶制作工艺。首先将丝素蛋白溶解,得到丝素蛋白溶液,再将DMPG溶液加入到丝素蛋白溶液中,混合均匀后将细胞悬液加入到混合溶液中,然后用注射器将处于溶胶状态的丝素蛋白水凝胶注射到动物体内[22]。期望通过这种方式获得一种生物相容性良好的丝素蛋白水凝胶,能够为人类再生医学植入治疗肌肉损伤奠定基础。

图1 丝素蛋白水凝胶制作工艺示意Fig.1 Schematic diagram of silk fibroin hydrogel making process

1 实验

1.1 试剂

PBS缓冲液(杭州浩克生物技术有限公司),碳酸氢钠(上海阿拉丁生化科技股份有限公司),二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清、双抗、胰蛋白酶-EDTA消化液、胶原酶Ⅳ、CCK-8试剂盒、DAPI溶液、4%多聚甲醛、曲拉通Triton X-100(北京索莱宝科技有限公司),溴化锂(国药集团化学试剂有限公司),透析袋(上海索桥生物科技有限公司),F12培养基(杭州昊鑫生物科技有限公司),MYHC一抗、DESMIN一体、FITC标记的二抗(武汉爱博泰克生物科技有限公司),活细胞/死细胞双染试剂盒(翌圣生物科技(上海)股份有限公司),100 μm细胞筛网(康宁(上海)有限公司)。

1.2 仪器

烘箱(上海跃进医疗器械有限公司),载玻片及盖玻片(江苏汇达医疗器械有限公司),SI-A256涡旋仪(秒生科技有限公司),MC2掌上离心机(上海吉泰生物科技有限公司),ECLIPSE E100显微镜、ECLIPSE C1荧光显微镜(NIKON),KE003068移液枪(Dragon公司),SU8010台式扫描电子显微镜(日本松下公司),冻干机(香港力康发展有限公司),磁力搅拌器、iS50 FTIR傅里叶红外测谱仪、纯水仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司),KS-600D超声波水域锅(宁波海曙超声科技设备有限公司)。

1.3 丝素蛋白的制备

参照文献[23]的脱胶方法,利用丝素蛋白与丝胶蛋白溶解度不同来获得丝素蛋白,首先将蚕丝用剪刀剪为2～4 cm长度,按1︰200的浴比放入0.5%的碳酸氢钠溶液中煮沸30 min,期间每隔15 min用玻璃棒翻一次,煮好后用去离子水洗脱3次,此时丝胶蛋白溶解在0.5%碳酸氢钠溶液中;蚕丝煮好后用去离子水清洗6次,最后将脱胶的蚕丝放入烘箱,温度设置为37 ℃,干燥12 h后放入通风干燥处保存,即可得到丝素蛋白。

1.4 丝素蛋白溶液的制备

参照文献[23]的溶解方法,首先配置摩尔浓度为9.3 mol/L的溴化锂溶液。即1 L的烧杯中称取807.7 g无水溴化锂,加入600 mL超纯水溶解,使用磁力搅拌器使溴化锂完全溶解,冷却后加水到1 000 mL,使用循环水真空泵过滤溶液至澄清,得到澄清的9.3 mol/L的溴化锂溶液。将脱胶干燥后的丝素蛋白撕扯成蓬松的棉花状,事先将溴化锂溶液放入60 ℃的烘箱中预热30 min,之后将丝素蛋白与溴化锂溶液按照1︰4的溶质比溶解,丝素蛋白完全没入溴化锂溶液后再放入60 ℃恒温烘箱中继续溶解2 h,期间每隔15 min拿出来搅拌一次,溶解完毕后得到黄色的丝素蛋白—溴化锂混合溶液。将混合溶液放入透析袋中透析3 d,纱布过滤之后低温高速离心机7 000 r/min离心20 min,上清液用0.22 μm针头滤器过滤后放入4 ℃备用。

1.5 湖羊肌肉卫星细胞的获取

湖羊肌肉卫星细胞的分离采用胶原酶消化法:1) 无菌条件下,剥离湖羊胎儿后肢腿部肌肉组织,用75%乙醇轻微浸泡消毒后立即用PBS冲洗2次,放入盛有PBS的35 mm细胞培养皿中;2) 利用眼科剪将肌肉组织剪碎,加入适量Ⅳ型胶原酶后放入37 ℃、5% CO2培养箱中消化15 min,每隔5 min取出吹打一次,共3次;3) 消化结束后,加入2倍体积A培养基(F12培养基+10%胎牛血清)终止消化,用100目细胞筛过滤并收集细胞悬液至15 mL离心管中,低速离心机室温1 200 r/min离心15 min,弃上清液;4) 加入B培养基(F12培养基+10%胎牛血清+1%双抗)重悬细胞,将细胞悬液接种至100 mm细胞培养皿中,普通光学显微镜下观察细胞形态,放入37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。正常传代培养冻存,生长至对数生长期,后续用于注射湖羊体内。

1.6 湖羊肌肉卫星细胞的传代与冻存

将湖羊肌肉卫星细胞传至P2—P5代,显微镜下观察细胞形态。使用血细胞计数板计数,在细胞密度至少达到1×106mL时,进行传代培养,按照1︰3的比例进行传代培养。湖羊肌肉卫星细胞的冻存液采用“现配现用”的原则,将胎牛血清与二甲基亚砜(DMSO)按照10︰1的比例进行配比,在细胞密度达到1×106mL进行冻存。具体步骤为:在无菌条件下,首先用PBS洗去培养基,加入1 mL的胰酶进行消化,消化结束后,加入2倍体积A培养基(F12培养基+10%胎牛血清)终止消化,低速离心机室温1 200 r/min离心5 min,弃上清液,加入1 mL冻存液重新悬浮细胞,放入2 mL冻存管中,将冻存管放入冻存盒中,-80 ℃保存24 h后放入液氮长期保存。

1.7 湖羊肌肉卫星细胞的鉴定

1) 将生长至对数生长期的湖羊肌肉卫星细胞在24孔细胞培养皿中培养至70%～80%密度;

2) 移除培养基,用预冷的PBS缓冲液洗5次,每孔加入200 μL的4%多聚甲醛,将细胞培养皿放入冰上,固定15 min;

3) 移液枪移除多聚甲醛,用PBS洗5次,每孔加入200 μL 0.25% Triton X-100对细胞进行透化10 min;

4) 移除0.25% Triton X-100,之后用PBS洗5次,每孔加入200 μL封闭液(含0.25% Triton X-100的PBS),放入4 ℃过夜;

5) 移除封闭液,用PBS洗5次,按照1︰100的比例稀释一抗,每孔加入100 μL一抗稀释液,4 ℃孵育24 h;

6) 移除一抗,用PBS洗5次,按1︰50的比例稀释二抗,每孔加100 μL二抗稀释液,室温避光孵育1 h;

7) 移除二抗稀释液,用PBS洗5次,每孔加入100 μL DAPI染液,避光孵育15 min,PBS洗5次,彻底洗去DAPI染液,使用荧光显微镜观察。

1.8 丝素蛋白水凝胶的制备

制备的方法采用物理混合的方法,将丝素蛋白溶液(质量分数为3%),分别与三种摩尔浓度DMPG溶液混和。具体过程为:首先将DMPG与去离子水水和,然后超声波水浴加热30 min,将丝素蛋白溶液烘干称重(一般为6%),两者混合后保持DMPG的终摩尔浓度依次为5、10、15 mmol/L,丝素蛋白终质量分数为3%,制得三种摩尔浓度的胶块,放入4 ℃以便后续测定使用。

1.9 水凝胶结构测试

取适量冻干后的水凝胶样品于研钵中,加入溴化钾研磨均匀,压片并在傅里叶红外光谱仪中进行测试。仪器的分辨率为4 cm-1,扫描32次,检测范围为4 000～400 cm-1。谱图的采集和分析均使用Thermo Fisher公司的OMNIC 8.0软件,并将获得的数据导入到Prism 8.0中进行绘制。

1.10 细胞活力影响测定

选择生长至对数生长期的湖羊肌肉卫星细胞,使用浸提液的方法测定丝素蛋白水凝胶对细胞毒性的影响。具体步骤为:1) 将丝素蛋白水凝胶材料用75%乙醇浸洗5 min,然后用磷酸缓冲溶液PBS浸洗5 min,反复3次后加入纯培养基直至没过材料,静置24 h后作为浸提液备用;2) 在96孔板中接种湖羊肌肉卫星细胞悬液,在潮湿的培养箱中预培养24 h(37 ℃、5% CO2),更换细胞培养液,然后加入10 μL先前制备好的丝素蛋白水凝胶浸提液,不加浸提液作为空白组;3) 将培养板在细胞培养箱中培养12～48 h,取出湖羊肌肉卫星细胞培养板,向板的每个孔中加入110 μL CCK-8培养基混合液,将细胞板在培养箱中孵育30 min后取出,然后使用酶标仪在450 nm波长条件下测定各孔吸光度,取平均值并通过对照组评定材料的细胞毒性。

1.11 Masson切片染色及分析

取对数生长期(P2—P5代)的湖羊肌肉卫星细胞,细胞密度控制在1×105mL,终摩尔浓度DMPG为10 mmol/L,丝素蛋白终质量分数为3%,分装低温运送至羊场,无菌混合后,10 min后注射入湖羊耳朵,无细胞组作为对照,每组加一个不做处理的空白,做好标记归圈饲养。采集不同天数的湖羊组织耳朵组织进行Masson染色,先将石蜡切片脱蜡至水,再将切片放入无水乙醇和二甲苯等量混合溶液中15 min,接着在二甲苯溶液中处理20～40 min;然后在100%无水乙醇中处理10 min,95%无水乙醇中处理5 min,90%无水乙醇中处理5 min,80%无水乙醇中处理5 min,70%无水乙醇中处理5 min;最后使用蒸馏水洗。重铬酸钾媒染剂过夜,切片脱蜡至水后,重铬酸钾标准液常温过夜(约17 h)。Masson染色试剂盒内丽春红酸性品红液染5～10 min,蒸馏水快速漂洗。

磷钼酸处理:Masson染色试剂盒内磷钼酸水溶液处理1～2 min。苯胺蓝染色:不用水洗,直接用Masson染色试剂盒内苯胺蓝液复染5 s。分化:三缸1%冰醋酸依次处理5～10 s。脱水封片:三缸无水乙醇、正丁醇分别快速脱水15～30 s,二甲苯透明,中性树脂胶封片。显微镜镜检,图像采集分析。

染色结果:胶原纤维、黏液、软骨呈蓝色;肌纤维、纤维素和红细胞呈红色。

2 结果与分析

2.1 湖羊肌肉卫星细胞的培养与鉴定

从图2可以看出,湖羊肌肉卫星细胞具备了分化为肌肉细胞的能力。将分离得到的湖羊肌肉卫星细胞进行传代培养,将P2代(图2(a))湖羊肌肉卫星细胞放在显微镜下观察,湖羊肌肉卫星细胞呈梭形,细胞增殖能力强,细胞相互之间聚集但未发生融合,复合肌肉卫星细胞的特征;将P5代(图2(b))湖羊肌肉卫星细胞放在显微镜下观察,发现肌肉细胞相互融合,而且细胞形态向成熟的肌细胞发生改变,细胞增殖能力下降。为了进一步验证湖羊肌肉细胞是否为肌肉细胞,在P2代(图2(c))做免疫荧光染色,P2代湖羊肌肉卫星细胞未检测到Myod1细胞表面标志物(绿色荧光)的表达,只表达了细胞核的蓝色荧光;将培养至P5代(图2(d))做免疫荧光,检测到Myod1细胞表面标志物(绿色荧光)的表达,说明湖羊肌肉卫星细胞表达了肌肉相关的表面标志物。提取的湖羊肌肉卫星细胞具备了分化为肌肉细胞的能力,且细胞活力较好。

图2 湖羊肌肉卫星细胞鉴定结果Fig.2 Hu sheep muscle satellite cell identification results

2.2 丝素蛋白水凝胶红外光谱图

从图3结果可以看出,丝素蛋白水凝胶支撑结构主要是β折叠。红外结果显示,DMPG并没有改变丝素蛋白水凝胶的结构,加快凝胶的原理是蛋白质和脂质之间的静电和或疏水相互作用,诱导蛋白质构象变化。各个摩尔浓度的红外光谱如图3(b)所示,可以看出10 mmol/L和15 mmol/L的丝素蛋白水凝胶在波长为1 632 cm-1(酰胺Ⅱ谱带)、1 523 cm-1(酰胺Ⅱ谱带)、2 930 cm-1(C—H伸缩振动)3 280 cm-1(—COOH)处出现了蛋白质的特征吸收峰;5 mmol/L的DMPG蛋白特征峰不明显。DMPG诱导的丝素蛋白水凝胶的蛋白质特征峰未发生偏移,保留了主要的酰胺Ⅱ结构中的β折叠结构。

图3 傅里叶红外结果Fig.3 Fourier infrared results

2.3 丝素蛋白水凝胶生物相容的测定

从图4可以看出,DMPG诱导的丝素蛋白水凝胶具有良好的细胞相容性。本文分别选取了不同摩尔浓度DMPG,依次为5、10、15 mmol/L,丝素蛋白浓质量分数为3%。从图4(a)可以看出,加入丝素蛋白浸提液12 h后,三组OD值几乎没有差异,最高的是10 mmol/L丝素蛋白水凝胶处理组;从图4(b)可以看出,10 mmol/L的丝素蛋白水凝胶与细胞培养24 h后,OD值几乎没有任何变化,其余处理组OD值降低,其中空白处理组高于5 mmol/L和15 mmol/L处理组;从图4(c)可以看出,10 mmol/L的丝素蛋白水凝胶与细胞培养36 h后,OD值升高,空白对照组OD值与24 h的OD值没有发生变化;从图4(d)的结果可以看出,细胞与丝素蛋白水凝胶浸提液共培养48 h后,只有10 mmol/L的OD值保持在2.0左右的水平,其余处理组均徘徊在1.0～1.2。结果反映出了不同摩尔浓度之间的丝素蛋白水凝胶对细胞的影响,其中10 mmol/L处理组的随着与细胞培养时间的增加OD值逐渐增加,OD值反映了细胞活力的大小,细胞活力越大,OD值越高,10 mmol/L的丝素蛋白水凝胶是3种摩尔浓度中细胞相容性最好的。

图4 不同摩尔浓度的丝素蛋白水凝胶浸提液对细胞OD值影响的结果Fig.4 Results of the effect of the silk filament hydrogel extract of different mol concentrations on the cell OD value

2.4 肌肉生成与支架降解的分析

从图5可以看出,丝素蛋白水凝胶能够在湖羊体内凝结,并且使水凝胶内的湖羊肌肉卫星细胞增殖分化为新的肌肉组织,最后随着植入天数的增加,丝素蛋白水凝胶逐渐降解。从图5(a)可以看出,丝素蛋白水凝胶在第11天时基本降解完成;从图5(b)可以看出,丝素蛋白水凝胶(含湖羊肌肉卫星细胞)在湖羊体内凝结,蓝色区域为胶原纤维,即丝素蛋白水凝胶;从图5(c)可以看出,丝素蛋白水凝胶(不含湖羊肌肉卫星细胞)在湖羊体内凝结,蓝色区域比含细胞的水凝胶较小;从图5(d)可以看出,正常肌肉组织的状态,与植入水凝胶的肌肉组织形成鲜明的对照。图5(e～g)则直观地显示了丝素蛋白水凝胶在植入湖羊体内1～11 d过程中水凝胶发生降解和肌肉再生,Masson染色将丝素蛋白水凝胶染成蓝色,蓝色部分随着植入湖羊体内的天数逐渐降解;同时,Masson染色将肌纤维染成红色,红色部分随着植入的天数增加逐渐成熟,肌纤维数量更多而且直径变粗。