NK细胞及其受体表达与再生障碍性贫血的相关性研究

孔令环,王雪野,邢明雨,吕作福,艾英莉,邵万艳,魏灼如

(吉林省人民医院，吉林 长春130021)

再生障碍性贫血(AA)是一种由多种原因引起的造血功能衰竭综合征，近年来被国内外研究者定义为一种涉及免疫机制异常所导致的自身免疫性疾病[1-2]，免疫细胞如T细胞、自然杀伤细胞(NK)的平衡紊乱及分泌的造血负调控因子诱导了造血干/祖细胞的异常损伤和凋亡，引起造血衰竭，是再生障碍性贫血发生的重要原因。本研究利用流式细胞术对重型再生障碍性贫血(SAA)病人及非重型再生障碍性贫血(NSAA)病人外周血NK细胞数量及功能变化的研究，探讨NK细胞在AA发病机制中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象2017年6月至2020年2月吉林省人民医院血液科收治再生障碍性贫血病人初治28例(重型(SAA)9例，非重型(NSAA)19例)，其中男12例，女16例，年龄14-86岁，中位年龄61岁。按照张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》(第3版)[3]，符合再生障碍性贫血的诊断标准。同时，选择本院健康志愿者18例为对照组，男8例，女10例，年龄27-58岁，中位年龄45岁；所有检测均知情同意。

1.2 检测方法受试者清晨空腹静脉采血2 ml，EDTA抗凝。采用微量全血免疫荧光技术标记NK细胞，6 h检测完毕。抗体为Beckman Coulter 公司鼠抗人CD3-ECD、CD56-PC5、CD16-PC5、CD314(NKG2D)-FITC、CD159((NKG2A)- PE、颗粒酶granzymeβ-PE、穿孔素 perforin-FITC，破膜剂及溶血剂。常规方法标记细胞后用Beckman Coulter公司EPICS-XL型流式细胞仪，应用EXPO32ADCXL4 Color软件分析，在FSC-SSC散点图上选定淋巴细胞群，分析10000个细胞，结果以百分率表示。本试验检测的NK细胞包括CD16dimCD56bright亚型和CD16brightCD56dim亚型。同时常规进行T淋巴细胞亚群的检测。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 AA病人外周血NK细胞数量及受体表达的变化(表1)

SAA组病人外周血NK细胞数，NKG2D，NKG2A，颗粒酶表达减少，与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；穿孔素表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

NSAA组病人外周血NK细胞数，NKG2D，颗粒酶表达减少，与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；NKG2A和穿孔素表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

SAA组病人外周血NK细胞抑制性受体NKG2A表达增加，与NSAA组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 AA病人外周血NK细胞数量及受体表达的变化

2.2 AA病人NK细胞及其受体表达与造血指标的相关性分析

NSAA病人活化性受体NKG2D表达与血红蛋白含量(r=0.979，P=0.007)、血小板数(r=0.943，P=0.018)有相关性；颗粒酶表达与血红蛋白含量(r=0.942，P=0.018)、网织红细胞(r=0.906，P=0.029)有相关性；NK数量，NKG2A,穿孔素表达与白细胞、血红蛋白、血小板、网织红细胞等造血指标无相关性。

SAA病人NK细胞胞浆穿孔素表达与网织红细胞数有相关性(r=0.907，P=0.046)；NK数量，NKG2D，NKG2A,颗粒酶表达与白细胞、血红蛋白、血小板、网织红细胞等造血指标无相关性。

2.3 AA病人外周血T淋巴细胞亚群的变化(表2)

NSAA组病人CD3+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞比例增高，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；SAA组病人CD4+T淋巴细胞减低，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；SAA组病人B淋巴细胞比例增高，与对照组差异有统计学意义(P<0.05)，与NSAA组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

SAA组与NSAA组比较，CD3+T淋巴细胞比例减低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 AA病人NK细胞与T淋巴亚群的相关性分析

NSAA病人NK细胞的活化性受体NKG2D表达与CD3+T淋巴细胞(r=0.984，P=0.005)有相关性；NK细胞的胞浆颗粒酶表达与CD3+T淋巴细胞(r=0.865，P=0.042)，CD8+T淋巴细胞(r=0.928，P=0.022)，CD4+/CD8+(r=0.942，P=0.018)、B淋巴细胞(r=-0.877，P=0.038)有相关性；其他指标没有相关性。

表2 AA病人外周血T淋巴细胞亚群的变化

SAA病人NK细胞数与CD4+T淋巴细胞有相关性(r=0.988，P=0.006)，其他指标没有相关性。

3 讨论

目前为止，AA的病因和发病机制尚没有完全清楚，国内外研究[4-5]已经证实，T淋巴细胞免疫异常是AA发病机制之一；林赠华等报道[6],免疫介导的再生障碍性贫血小鼠模型的研制，以及Young等[7]的研究也证明T 淋巴细胞的异常活化和功能亢进造成的骨髓损伤在原发性获得性AA发病机制中占主导地位。本研究发现NK细胞在AA疾病进程中也起到重要作用。

NK细胞是机体免疫系统的重要组成部分，通过与DC、T细胞、B细胞相互作用，不仅调解固有免疫应答，而且参与调解获得性免疫应答，是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁[8]。NK细胞与T细胞的相互作用是通过膜上CD16、CD56与Th细胞膜上CD4发生免疫黏附[9]，同时激活巨噬细胞释放IL-1，使Th细胞激活，活化的Th细胞分泌IL-2，IFN-γ等，促进CTL细胞分化成熟，从而增强T细胞的免疫效应。NK细胞还可以通过DC细胞间接激活Th1细胞[10]。

T淋巴细胞主要参与细胞免疫，其数量及比例关系在体内处于相对稳定状态。本研究中，NSAA组病人抑制性CD8+T淋巴细胞比例增高，SAA组病人辅助性CD4+T淋巴细胞比例减低，都引起CD4+/CD8+比例失衡，T淋巴细胞免疫异常，引起造血细胞的免疫损伤，骨髓衰竭，引起血细胞减少，与报道一致[11-12]。本研究还发现，NSAA组病人NK细胞的NKG2D、颗粒酶表达与CD3+T淋巴细胞有相关性，SAA组病人NK细胞数与辅助性CD4+T淋巴细胞有相关性，可以认为NK细胞间接参与了造血调控。

本研究中，无论SAA组或NSAA组病人外周血NK 细胞数量均低于对照组(P<0.05)，同金梦迪等[13-15]报道一致。NK细胞通过自身表面的活化性和抑制性受体，调节自身的细胞毒性。NKG2D是最重要的活化性受体之一，本研究中，SAA组和NSAA组病人外周血NK细胞活化性受体NKG2D表达均低于对照组，杀伤功能减弱；NK细胞的第二种杀伤途径是细胞毒作用，NK细胞的细胞毒作用的发挥主要依赖于细胞溶解蛋白(如穿孔素和颗粒酶)的产生和释放[16-17]，本研究中SAA组和NSAA组病人外周血NK细胞胞浆颗粒酶表达均明显低于对照组，细胞毒作用减低。以上综合因素导致NK细胞对DC的杀伤作用减弱[18]，引起T细胞异常激活，分泌大量造血负调控因子IFN-γ等，引起骨髓造血衰竭，导致AA的发生。

本研究发现，NK细胞与造血指标有相关性。NSAA组病人的NK 细胞活化性受体NKG2D和颗粒酶表达与血红蛋白含量有相关性；NKG2D表达与血小板数有相关性；颗粒酶表达与网织红细胞有相关性。SAA组病人NK细胞胞浆穿孔素表达与网织红细胞有相关性。所以，临床AA的治疗方案可以考虑通过提高NK细胞活性来提升造血指标，与Liu 等[19]报道一致，外周血 NK 细胞及其亚群在初治 SAA 病人中均低于正常对照组，IST 治疗后均升高，尤其以 CD56bright NK 细胞亚群变化最明显，且这些变化与 SAA 病人的造血恢复情况呈正相关；因此有研究者[20]提出 NK 细胞参与了 SAA 的发生、发展，但其并非起“致病”性作用，而有可能起“保护”性作用。

SAA组病人外周血NK细胞抑制性受体NKG2A表达高于对照组，也高于NSAA组。抑制性受体NKG2A表达高，代表NK细胞识别能力增强，不确定与SAA组病人的急、重等临床症状是否相关，有待进一步研究。另外，SAA组病人B淋巴细胞明显高于NSAA组，也高于对照组，体液免疫是否参与了SAA的疾病进程也有待下一步研究。

通过NK细胞与T淋巴细胞亚群及各造血指标的相关性分析，可以认为NK细胞直接或间接参与了骨髓造血调控，与造血干/祖细胞的异常损伤和凋亡相关，是再生障碍性贫血发生的重要环节。