QuEChERS/高效液相色谱－串联质谱法测定护肤品中的21种麻醉剂

杨建英，朱 虹，徐 宁，陈晓红，陈 庆，肖 珩

（广东省汕头市质量计量监督检测所，广东 汕头 515041）

随着我国经济的高速发展和人们生活水平的日益提高，护肤品已成为必不可少的日用品。护肤品种类丰富，由于具有祛斑、祛痘、修护等功效，一直备受消费者青睐。临床上常用的利多卡因、丙氧卡因等麻醉剂，可暂时使神经冲动被可逆性地阻断，使局部疼痛、瘙痒在人的神志清醒状态下短暂消失，因而可能被添加于宣称具有祛斑、祛痘、修护、舒缓等功效的护肤品中，起到使面部肌肤短暂麻痹，痛感暂时消除的效果。但其能引起局部麻醉药全身毒性（LAST）［1］和心脏毒性，消费者长期使用可能对身体健康造成危害。麻醉类药品已被《化妆品安全技术规范（2015版）》［2］列入化妆品禁用原料目录中。然而，随着医学水平的不断发展，麻醉类药物种类远不止7种，常用的还有美索卡因、丙氧卡因、丙胺卡因等多种麻醉类药物。为进一步加强护肤品的安全监管，保障消费者安全，应扩大麻醉类药物的检测范围。近年来关于麻醉剂的检测方法主要有毛细管电泳法［3－4］、气相色谱法［5］、气相色谱－质谱法［6］、离子色谱法［7］、液相色谱法［8－12］、液相色谱－串联质谱法［13－18］等，主要涉及农产品、化妆品、药物、血浆、唾液、外用成人用品、医疗美容产品等。其中液相色谱－串联质谱法具有选择性好、灵敏度高、抗干扰能力强等特点，目前已成为高通量分析最主要的检测手段。已报道的液相色谱－串联质谱测定多种麻醉剂的研究大多采用含C18填料的色谱柱以反相模式分离化合物，往往会出现色谱保留与质谱响应难以兼顾的情形。

与以往报道的方法不同，本文以QuEChERS为前处理手段，创新性地采用Acclaim Mixed－Mode WCX－1混合模式色谱柱配合高效液相色谱－串联质谱法（HPLC－MS/MS）对护肤品中的21种麻醉剂进行测定，既增强了目标组分的保留，又提升了正模式下的响应，实现了分离度与灵敏度的兼顾，为液质联用分析麻醉剂这类碱性化合物提供了一种新思路。本方法的建立可为护肤品中违禁使用的麻醉类药物分析提供技术支持，提高护肤品安全风险的监控水平。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

QTRAP 5500液相色谱－质谱联用仪（美国AB SCIEX公司）；ME 204电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；pH计（PHS－3C型，上海仪电科学仪器股份有限公司）；Multi Reax旋涡振荡器（德国Heidolph公司）；SB25－12DT超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；3－18KS高速离心机（德国Sigma公司）。

标准物质：普鲁卡因胺、普鲁卡因、苯佐卡因、利多卡因、丁卡因、三卡因、甲哌卡因（纯度 ≥98%，坛墨质检科技股份有限公司）；布比卡因、罗哌卡因、盐酸辛可卡因、丙胺卡因（纯度 ≥ 83%，曼哈格（上海）生物科技有限公司）；盐酸普莫卡因、布他卡因、利索卡因、盐酸氯普鲁卡因（纯度 ≥ 98%，天津阿尔塔科技有限公司）；可卡因（1 mg·mL−1，美国Cerilliant公司）；美索卡因、丁氧卡因、丙美卡因（纯度 ≥ 98%，加拿大ECO公司）；阿米卡因（纯度99.8%，广州佳途科技股份有限公司）；盐酸丙氧卡因（纯度97.0%，加拿大TRC公司）。

试剂与材料：甲醇、乙腈（HPLC级，瑞典Oceanpak公司）；甲酸（HPLC级，上海安谱实验科技股份有限公司）；甲酸铵、乙酸铵（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；QuEChERS盐析试剂包（含1.5 g乙酸钠和6.0 g无水硫酸镁）、QuEChERS净化试剂包（含400 mg十八烷基键合硅胶（C18）、400 mg N-丙基乙二胺（PSA）、1 000 mg无水硫酸镁）（美国Agilent公司）；实验用水为超纯水，由arium mini plus超纯水器（德国Sartorius公司）制备；针式过滤器（0.2 µm，PTFE（亲水性），赛默飞世尔科技（中国）有限公司）。

1.2 实验步骤

1.2.1样品预处理准确称取均匀试样0.5 g（精确至0.001 g）于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL水，充分涡旋分散后，准确加入10 mL乙腈（含1.0%甲酸，体积分数，下同），涡旋提取1 min，超声提取20 min后，加入盐析试剂包（含1.5 g乙酸钠和6.0 g无水硫酸镁），振摇1 min，以5 000 r·min−1离心5 min。移取5 mL上清液于15 mL聚丙烯离心管中，加入净化试剂包（含400 mg C18、400 mg PSA、1 000 mg无水硫酸镁），涡旋混匀1 min，以5 000 r·min−1离心5 min，吸取上清液过0.2 µm PTFE滤膜，待分析。

1.2.2标准溶液配制取适量标准物质，用甲醇溶解稀释，分别制备成100 µg·mL−1的标准储备溶液。取适量单标储备液，用甲醇逐级稀释成质量浓度分别为1 000 ng·mL−1和100 ng·mL−1的混合标准中间液。称取与该待测样品基质类型相同的空白样品0.5 g（精确至0.001 g）6份，分别加入适当浓度的混合标准中间液，按“1.2.1”步骤处理，配制成质量浓度为0.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100 ng·mL−1的系列基质标准工作溶液。

1.3 仪器工作条件

1.3.1色谱条件色谱柱：Acclaim Mixed－Mode WCX－1色谱柱（150 mm × 2.1 mm × 3 µm，赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；柱温：40 ℃；进样体积：2 µL；流动相：A相为20 mmol·L−1甲酸铵溶液（用甲酸调至pH 4.0），B相为乙腈（含0.035%甲酸），流速为0.3 mL/min。梯度洗脱条件：0 ~ 1.0 min，10% B；1.0 ~ 6.0 min，10% ~ 60% B；6.0 ~ 8.0 min，60% B；8.0 ~ 9.0 min，60% ~ 90% B；9.0 ~ 11.0 min，90% B；11.0 ~ 12.0 min，90% ~ 10% B；12.0 ~ 15.0 min，10% B。

1.3.2质谱条件离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正模式；采集方式：多反应监测（MRM），离子源喷雾电压（IS）：5 500 V；离子源加热温度：600 ℃；气帘气（CUR）压力：0.207 MPa；雾化气（GAS1）压力：0.414 MPa；加热辅助气（GAS2）压力：0.379 MPa；其他质谱参数见表1。

表1 21种麻醉剂的质谱参数Table 1 MS parameters of the 21 anesthetics

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1色谱柱的选择本研究中的21种麻醉剂多为中性或碱性物质，目前已报道的液相色谱－串联质谱方法［13－18］较多采用C18色谱柱以反相模式分离化合物。文献［13，15，17］通过在流动相中添加0.1%甲酸，在正模式下增强了电离效果，但会在一定程度上导致麻醉剂的色谱保留减弱，部分化合物（如普鲁卡因胺、普鲁卡因）在1 min内出峰，而目标化合物出峰过早易受到样品基质的干扰；文献［14］在流动相中添加氨水提高流动相pH值以增强麻醉剂的色谱保留，但会抑制正模式的响应，为达到合适的方法检出限，需使用离子淌度差分质谱提高方法的灵敏度。因此，液相色谱－串联质谱方法在分析碱性化合物时，会出现色谱保留与质谱响应难以兼顾的情形。此外，流动相pH值较低或较高，易对液相色谱系统管路造成腐蚀、磨损，对液相色谱管路耐受性的要求也会更高。

本研究采用的Acclaim Mixed－Mode WCX－1色谱柱能够在单一键合相上提供多种保留机制，选择性与C18反相色谱柱互补。该色谱柱的键合相为带有羧基末端的疏水烷基链键合硅胶，疏水烃链提供反相保留（RP），羧基端基提供弱阳离子交换（WCX），适用于含伯仲叔胺及季铵结构、有机胺类、含氮杂环结构等碱性化合物的分析［19－20］。普鲁卡因胺的结构式中含苯环、伯胺、仲胺和叔胺等官能团，酸度系数pKa为9.24，该碱性化合物在传统反相色谱柱上的保留较弱，出峰时间接近死时间［13，15，17］。本方法使用Acclaim Mixed－Mode WCX－1色谱柱分析此类碱性化合物时，选择较为“温和”的流动相条件（pH值为3.0 ~ 6.5），该色谱柱的羧基端基与含氮官能团进行离子交换，疏水烃链与苯环进行反相保留，使得普鲁卡因胺的保留显著增强，岀峰时间在4 min左右（见图1A），可有效避免样品基质干扰，实现准确定性和定量。此外，尝试采用Waters Symmetry C18色谱柱（150 mm × 2.1 mm，3.5 µm）在相同色谱－质谱条件下进行测试，色谱图如图1B所示。结果表明，Acclaim Mixed－Mode WCX－1色谱柱对21种麻醉剂的分离保留效果更好。因此，实验采用Acclaim Mixed－Mode WCX－1混合模式色谱柱配合HPLC－MS/MS测定护肤品中21种麻醉剂的含量，在确保化合物响应的前提下，使目标组分的保留增强，实现了分离度与灵敏度的兼顾。

图1 2种不同色谱柱对21种麻醉剂的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of 21 anesthetics by 2 different chromatographic columns

2.1.2流动相的选择采用选定的色谱柱，在混合模式分离机制下以缓冲盐和有机相为流动相体系。考虑到该色谱柱适用的缓冲盐浓度范围，以及尽可能使用较低浓度的缓冲盐添加剂以降低对质谱系统的污染，选择缓冲盐浓度为20 mmol·L−1。实验首先考察了目标化合物在20 mmol·L−1甲酸铵溶液－乙腈和20 mmol·L−1乙酸铵溶液－乙腈两种流动相体系下的质谱响应。结果表明，在20 mmol·L−1甲酸铵溶液－乙腈流动相体系下，大多数麻醉剂的质谱响应更高。质谱正模式下，为增强目标化合物的响应值，在20 mmol·L−1甲酸铵溶液中添加甲酸。进一步考察了相同洗脱梯度下，20 mmol·L−1甲酸铵溶液的pH值分别为4.0、5.0和6.0时，各目标化合物的质谱响应和同分异构体的分离情况。实验表明，上述3种pH值条件下苯佐卡因和三卡因、丙美卡因和丙氧卡因这2对同分异构体均获得良好的分离，当20 mmol·L−1甲酸铵溶液的pH值为4.0时，大多数麻醉剂的质谱响应更高，因此采用流动相的pH值为4.0。实验同时发现，当有机相不加甲酸时，普鲁卡因胺的峰形拖尾，在有机相乙腈中加入体积分数为0.035%的甲酸时，普鲁卡因胺的峰形显著改善。因此，最终采用20 mmol·L−1甲酸铵溶液（用甲酸调至pH 4.0）－乙腈（含0.035%甲酸）作为流动相，并进一步优化梯度洗脱程序。21种麻醉剂（100 ng·mL−1）的MRM色谱图见图1A。

2.2 质谱条件的优化

21种麻醉剂的化学性质使之在正离子扫描模式下更易离子化。在ESI+模式下，分别对质量浓度为50 ng·mL−1的21种麻醉剂标准溶液进行母离子扫描，均可获得响应最好的准分子离子峰，且均为［M +H］+峰。对母离子进行子离子扫描，选择响应较强、干扰较小的2个子离子作为定性离子，其中响应最大的子离子作为定量离子，最后分别对每种麻醉剂的去簇电压和碰撞能量进行优化。优化后的质谱条件见表1。

2.3 提取条件的优化

QuEChERS法的常用提取溶剂为乙腈，实验采用乙腈作为提取溶剂进行考察。若在样品中直接加入乙腈，膏霜类等样品的复杂基质不易分散，所以先加入水使样品充分分散混匀后再加入乙腈进行提取。在空白样品中加入21种麻醉剂的混合标准溶液，按照“1.2.1”步骤，考察了乙腈、乙腈（含0.1%甲酸）、乙腈（含0.5%甲酸）和乙腈（含1.0%甲酸）作为提取溶剂时21种麻醉剂的提取回收率，结果见图2。由图2可知，大约50%组分的提取回收率受甲酸体积分数的影响不大，但有50%的麻醉剂在乙腈（含1.0%甲酸）作为提取溶剂时的提取回收率明显高于其他3种提取溶剂，故实验选取乙腈（含1.0%甲酸）作为提取溶剂。

图2 提取溶剂对样品中21种麻醉剂提取回收率的影响Fig.2 Effect of variety of extraction solvent on the recoveries of 21 anesthetics in samples

2.4 净化条件的选择

护肤品基质主要有脂类（角鲨烷、合成甘油三酯等）、蜡类（蜂蜡、石蜡等）和有机酸等。QuEChERS方法常用的吸附剂中，C18可吸附脂类、蜡类等非极性杂质，PSA可吸附有机酸、色素及金属离子等，无水硫酸镁可吸收有机相中残留的水分，所以实验选取含C18、PSA以及无水硫酸镁的QuEChERS净化试剂包作为净化吸附剂。

2.5 基质效应评价

护肤品的基质较为复杂，因此对21种麻醉剂的基质效应进行了考察。基质效应（Matrix effect，ME）按照公式ME=（基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率）× 100%计算。ME越接近100%，表明基质效应越小。ME在80% ~ 120%范围内，表明存在基质效应，但影响较低，可忽略不计；超出此范围则表明基质效应较明显。选择膏霜、乳液和凝胶3种具有代表性的复杂基质，通过实验分别获得21种麻醉剂的基质匹配标准曲线和溶剂标准曲线，计算ME值。由表2可知，21种麻醉剂在3种基质中存在不同程度的基质效应，且以基质抑制为主。因此，通过基质匹配标准曲线进行定量，以更准确地反映护肤品中21种麻醉剂的含量。

表2 21种麻醉剂在不同基质中的回收率、相对标准偏差（n = 6）和基质效应Table 2 Recoveries，relative standard deviations（n = 6） and matrix effects of 21 anesthetics in different matrices

（续表2）

2.6 线性方程、检出限与定量下限

在“1.3”条件下，对21种麻醉剂的系列基质混合标准工作溶液进行测定，以化合物定量离子的色谱峰面积为纵坐标（y），以各组分的质量浓度为横坐标（x，ng·mL−1）绘制标准曲线，计算线性方程和相关系数。以空白样品的3倍信噪比确定检出限（LOD，S/N= 3），10倍信噪比确定定量下限（LOQ，S/N= 10）。由表3可知，21种麻醉剂在0.5 ~ 100 ng·mL−1质量浓度范围内线性良好，相关系数（r）均大于0.99，方法检出限为0.1 ~ 3 µg·kg−1，定量下限为0.3 ~ 10 µg·kg−1。

表3 21种麻醉剂的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量下限Table 3 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients，LODs and LOQs of 21 anesthetics

2.7 加标回收实验

分别选取具有代表性的膏霜、乳液和凝胶3种护肤品进行加标回收实验。称取经检测不含21种麻醉剂的样品，分别添加低、中、高3个水平的混合标准溶液于样品中，分别做6次平行实验。由表2可知，在3个加标水平下，21种麻醉剂的平均回收率为84.3% ~ 109%，相对标准偏差（RSD）为0.70% ~7.1%，表明本方法的准确度和精密度良好。

2.8 实际样品分析

应用本方法对市面45批次护肤品进行测定，其中1批次样品检出利多卡因（含量为107 mg·kg−1），1批次样品检出丙胺卡因（含量为83.8 mg·kg−1），均为宣称具有舒缓功效的眼部护肤品。典型阳性样品（检出利多卡因）的色谱图见图3。其余样品均未检出本方法涉及的21种麻醉剂。

图3 阳性样品的MRM总离子流图（A）和利多卡因的提取离子流图（B、C）Fig.3 MRM total ion chromatogram（A） and extracted ion chromatograms of lidocaine（B，C） in a positive sample

3 结 论

本文建立了QuEChERS/高效液相色谱－串联质谱同时快速测定护肤品中21种麻醉剂的分析方法。该方法前处理简单，创新性地采用Acclaim Mixed－Mode WCX－1混合模式色谱柱对护肤品中的21种麻醉剂进行含量测定，实现了分离度与灵敏度的兼顾，可在15 min内对21种麻醉剂进行快速筛查，检出限低，定性定量准确，可为护肤品的安全监管提供有力的技术支持。