UPLC－MS/MS测定海水、悬浮颗粒物及沉积物中18种藻毒素

李 静，晏 萌，沈金灿，肖陈贵，麦艳玲，李 杨，郭建宁，钟润生*

（1.深圳信息职业技术学院 交通与环境学院，广东 深圳 518172；2.香港城市大学 海洋污染国家重点实验室，香港 999077；3.深圳海关食品检验检疫技术中心 深圳市食品安全检测技术研发重点实验室，广东 深圳 518026）

有害藻华是威胁、危害海洋生态环境和人类健康的一种海洋灾害。近几十年来，由于不断加剧的人为压力以及逐渐恶劣的全球气候变化，有害藻华发生的频率及影响范围不断增大［1－2］。其相关的产毒微藻所产生的海洋藻毒素是目前已知的最毒的一类天然产物之一，易累积于各种海洋生物体内［2－3］，人类摄食藻毒素含量超标的海产品可引起各种食源性疾病［4－8］。目前，已在海洋环境及生物体中发现超过300种藻毒素［9－11］。典型的高毒性海洋藻毒素包括原多甲藻酸贝类毒素（AZAs）、裸藻毒素（BTXs）、太平洋雪卡毒素（P－CTXs）、鳍藻毒素（DTXs）、米氏裸甲藻贝类毒素（GYM）、刺尾鱼素（MTX3）、大田软骨酸贝毒素（OA）、扇贝毒素（PTX2）、螺环内酯毒素（SPX1）及虾夷扇贝毒素（YTXs）。海洋生物中藻毒素的水平主要受其栖息地环境污染状况和饮食偏好的影响［12－13］，海水、悬浮颗粒物及沉积物是其栖息地环境的重要组成部分。因此，开发多种藻毒素的高精密度痕量检测技术有助于阐释其在海洋环境中的迁移转化及归宿，为更有效地管理渔业资源及保障人类健康提供技术支持。

超高效液相色谱－串联质谱（UPLC－MS/MS）具有选择性好、灵敏度高、可比性和重复性好的优点，可同时定量分析多种藻毒素［14－16］，是目前进行目标及非目标藻毒素筛查最常用的方法之一。例如，王艳龙等［17］建立了测定海水悬浮颗粒物中8种典型脂溶性藻毒素的UPLC－MS/MS法；高莉媛等［18］建立了测定海洋微藻藻粉中8种脂溶性藻毒素的高效液相色谱－电喷雾离子阱质谱法；García－Altares等［19］建立了测定海产品中17种脂溶性藻毒素的UPLC－MS/MS法；Chen等［10］采用固相萃取法结合液相色谱－飞行时间质谱（LC－TOF MS）检测海水中的8种脂溶性藻毒素，回收率为30.2% ~ 83.3%。然而，由于藻毒素的结构和性质差异，上述方法均在电喷雾模式下采用正、负离子分开扫描检测，增加了检测成本及时间；UPLC－MS/MS在分析样品时不可避免地受到基质效应的影响，且前处理方法的萃取效率低，导致检测值偏高或偏低。因此亟需开发有效可靠的多种高毒性藻毒素的前处理方法，以降低基质效应，延长仪器及色谱柱的使用寿命，并结合高效、灵敏以及可正、负离子同时扫描的UPLC－MS/MS仪器以提高样品分析的准确性及效率，为良好明晰环境中藻毒素的污染状况和赋存状态，以及海洋生态系统的提前预警奠定基础。

本研究建立了一种固相萃取结合UPLC－MS/MS同时测定18种藻毒素的分析方法，对色谱－质谱条件及固相萃取和氮吹浓缩条件进行优化，达到了有效降低样品基质效应，并提高方法灵敏度的目的。该方法适用于同时快速检测实际海水、悬浮颗粒物及沉积物中的18种藻毒素。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290型超高效液相色谱仪（美国Agilent公司），API 5500型三重四极杆质谱仪配电喷雾离子源（美国AB SCIEX公司）；Phenomenex Kinetex C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm i.d.，1.7 µm，美国Phenomenex公司）；平行振荡器；20位固相萃取装置（美国Waters公司）；旋涡振荡混合器（美国Thermo公司）；Sigma冷冻离心机（最大转速14 000 r/min，美国Sigma公司）；TurboVap LU型氮吹浓缩仪（Caliper Life Sciences公司）；Eppendorf移液器（德国Eppendorf公司）；Agilent Bond Elut C18固相萃取柱（500 mg/6 mL）；Waters Oasis HLB固相萃取柱（500 mg/6 mL）；Phenomenex StrataX固相萃取柱（500 mg/6 mL）。

雪卡毒素标准品（P－CTX－1、P－CTX－2及P－CTX－3，纯度> 95%）由澳大利亚昆士兰大学Richard J. Lewis教授提供；刺尾鱼素（MTX3）标准品由新西兰考斯隆研究所提供；大田软骨酸毒素（OA）、鳍藻毒素（DTX1和DTX2）、扇贝毒素（PTX2）、米氏裸甲藻贝类毒素（GYM）、螺环内酯毒素（SPX1）、原多甲藻酸贝类毒素（AZA1、AZA2及AZA3）、虾夷扇贝毒素（YTX和homoYTX）标准品购自加拿大国家海洋研究中心；裸藻毒素（BTX2、BTX3及BTX9）标准品购自美国LKT实验室。甲醇和乙腈为HPLC纯（德国Merck公司）；甲酸、氯化钠、甲酸铵为HPLC纯，氨水及丙三醇为分析纯（美国Sigma公司）；实验用水由Milli－Q超纯水处理系统（美国Millipore公司）制备。

1.2 标准溶液的配制

准确取18种海洋藻毒素标准物质适量，用甲醇配制成质量浓度为1.0 µg/mL的单标储备液。按照一定的比例分别吸取各藻毒素单标储备液，用80%甲醇水配制成100 ng/mL的标准工作液，并按需逐级稀释，各标准溶液置于−20 ℃下保存备用。

1.3 色谱－质谱条件

色谱条件：Phenomenex Kinetex C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm i.d.，1.7 µm）；流动相：A相为水，B相为95%乙腈水，两相均含有0.1%甲酸和2 mmol/L甲酸铵。流速为200 µL/min，柱温为35 ℃，进样体积为5 µL。线性梯度洗脱，洗脱程序：0 ~ 1 min，20% B；1 ~ 6 min，20% ~ 80% B；6 ~ 8 min，80% B；8 ~ 10 min，80% ~ 100% B；10 ~ 14 min，100% B；14 ~ 14.1 min，100% ~ 20% B；14.1 ~ 19 min，20% B。

质谱条件：电喷雾电离源；P－CTX－1、P－CTX－2、P－CTX－3、PTX2、GYM、SPX1、AZA1、AZA2、AZA3、BTX2、BTX3及BTX9采用多反应监测（MRM）正离子模式（ESI+）检测，OA、DTX1、DTX2、MTX3、YTX、homoYTX采用MRM负离子模式（ESI−）检测；喷雾电压分别为5 500 V和−4 500 V，雾化气压力为207 kPa（GS1，30 psi），去溶剂气压力为276 kPa（GS2，40 psi），碰撞气压力为69 kPa（CAD，10 psi），离子源温度为400 ℃。18种藻毒素的分子式、保留时间（tR）、去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）、碰撞室出口电压（CXP）、入口电压（EP）值见表1。

表1 18种藻毒素的分子式、保留时间及质谱参数Table 1 The formulas，retention times and mass spectrometric parameters of 18 phycotoxins

（续表1）

1.4 样品前处理

海水样品用烘干至恒重的玻璃纤维滤膜（直径为47 mm，孔径为0.45 µm）进行过滤，收集固体悬浮颗粒物；将滤膜置于冻干机中冻干，通过十万分之一的电子天平称量和计算，得到悬浮颗粒物的质量。

已过滤海水（1 L）通过预先用10 mL甲醇和10 mL水活化的Agilent Bond Elut C18（500 mg/6 mL）固相萃取柱进行萃取，弃去流出液，用5 mL超纯水淋洗后抽干，再用5 mL甲醇及5 mL含0.3%氨水的甲醇依次洗脱。洗脱液中加入100 µL的10%丙三醇－甲醇溶液，随后于40 ℃下氮吹浓缩至0.5 mL，过0.22 µm有机膜，待检测。

冻干的悬浮颗粒物或沉积物样品（1 g）用3 mL 80%甲醇水超声提取3次，合并萃取液（约9 mL），加入超纯水将其稀释至25%甲醇水溶液中（约30 mL），后续固相萃取及氮吹浓缩处理步骤依照海水处理流程。

2 结果与讨论

2.1 色谱－质谱条件的优化

为获得满意的色谱分离效果和质谱灵敏度，对UPLC－MS/MS条件进行了优化。API 5500型三重四极杆质谱仪可同时运行正负电喷雾电离模式，实现18种藻毒素的同时检测，大大节省了分析成本。采用针泵式进样，对18种藻毒素的质谱参数进行优化，并选择出最优的母离子及子离子，具体参数如表1所示。

在最佳质谱条件下，对色谱流动相、柱温、进样体积等条件进行优化。乙腈和水是分析藻毒素最常规的流动相体系，当UPLC分离酸碱性物质时，色谱柱填料中的游离硅羟基与解离后目标物产生的二级作用导致色谱峰出现拖尾现象，在流动相中加入增强离子化的pH调节剂（甲酸/乙酸或氨水/三乙胺）和减少次级保留的缓冲盐（甲酸铵或乙酸铵），可减弱拖尾、改善峰形。例如，Yogi等［20］采用甲醇/水 + 0.1%甲酸 + 5 mmol/L甲酸铵酸性流动相分析了珊瑚鱼和冈比甲藻中的16种雪卡毒素；García－Altares等［19］比较了4种典型流动相体系即酸性（pH 2.6）、中性（pH 6.8）、弱碱性（pH 7.9）及碱性（pH 11）对海产品中17种脂溶性藻毒素分离效果的影响。基于此，本研究比较了乙腈/水和甲醇/水2种流动相体系在酸性、中性、弱碱性及碱性条件下18种藻毒素的色谱出峰情况。相比于酸性及碱性流动相，在中性和弱碱性色谱条件下18种目标物的分离效果及灵敏度无显著改善；虽然甲醇/水流动相体系下目标物的信号强度高于乙腈/水体系，但使用乙腈/水时两对同分异构体（P－CTX－2、P－CTX－3；OA、DTX2）可获得更佳的分离度；此外，部分目标物质（如CTXs、OA及DTXs）在碱性条件下的信号显著高于酸性条件，但AZAs呈现峰偏移且色谱峰过宽现象，且碱性条件会溶解色谱柱的硅胶填料，大大缩短色谱柱使用寿命，流动相更易变质及污染。因此，选择95%乙腈水/水（两相中加入0.1%甲酸和2 mmol/L甲酸铵）为流动相，18种藻毒素在6 min内分离良好，目标物的总离子流图如图1。

图1 酸性条件下18种藻毒素的总离子流图Fig.1 Chromatogram of 18 phycotoxins under acidic chromatographic conditions

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 固相萃取柱的选择采用合适的前处理方法可减少或降低基质效应并延长仪器和色谱柱的使用寿命，同时提高方法的定量下限。固相萃取是最常用的前处理方法之一，广泛应用于不同种类的样品如海水、悬浮颗粒物、沉积物、浮游植物、藻类和生物群样品［10，21－23］。其中，反相固相萃取柱在藻毒素样品制备中应用最广泛，因此考察了硅胶键合基体Agilent Bond Elut C18（500 mg/6 mL）以及聚合物基体Waters Oasis HLB（500 mg/6 mL）和Phenomenex StrataX（500 mg/6 mL）3种典型反相固相萃取柱对18种目标毒素的萃取效率［10，14，24－25］。

结果表明（图2），18种藻毒素在3种固相萃取柱上的回收率分别为84.0% ~ 116%、82.0% ~ 117%及74.0% ~ 123%。前2种固相萃取柱对18种藻毒素的萃取效率优于Phenomenex StrataX柱，且Phenomenex StrataX固相萃取柱耗时长。Agilent Bond Elut C18和Waters Oasis HLB固相萃取柱对18种藻毒素的萃取效率相当，然而对于结构高度氧化的梯状环聚醚类目标物P－CTXs和BTXs，Agilent Bond Elut C18的萃取效率（95.0% ~ 113%）整体高于Waters Oasis HLB柱（84.0% ~ 106%），可能是由于聚合物基体（二乙烯苯－含氮乙烯基团）对梯状环聚醚类物质的吸附作用强于硅胶基体（十八烷基），导致目标物难洗脱。综合考虑，最终选择Agilent Bond Elut C18固相萃取柱进行萃取。

图2 不同固相萃取柱对18种藻毒素回收率的影响（n = 3）Fig.2 Effects of different cartridges on the recoveries of 18 phycotoxins（n = 3）

2.2.2 氮吹浓缩对目标物回收率的影响为提高方法的灵敏度，通常采用氮气吹扫法浓缩样品。氮吹法的效果主要取决于温度、氮气流量、化合物性质和样品状态。为剔除基质效应的影响，找到目标物损失环节，首先在无基质情况下通过在前处理不同步骤添加目标藻毒素进行了加标实验，结果表明目标物BTXs、GYM及SPX1的回收率较低（BTXs为40% ~ 50%，GYM约为50%，SPX1约为45%），是由氮吹引起。

相关文献表明，不涉及氮吹的方法呈现出较好的回收率［26－27］，然而在氮吹浓缩时，相关研究呈现出随机的回收率较低情况［10，14－15］。为防止在氮吹过程中目标物的随机损失，选取丙三醇添加至洗脱液中以降低分析物的损失。丙三醇被广泛用作食品化学中的甜味剂和药物配方中的保湿剂，由于存在3个羟基，可与水混溶并具有吸湿性，已被应用于氮吹下减少黄曲霉素的损失［28］。在氮气吹扫下考察了添加不同体积的10%丙三醇－甲醇对18种藻毒素回收率的影响。如图3所示，在吹氮步骤中，洗脱液中添加10%丙三醇－甲醇对GYM、SPX1和BTXs的回收率有显著改善（p< 0.05），其回收率随着10%丙三醇－甲醇体积的增加而增加，而后达到稳定状态。GYM、SPX1和BTXs的平均回收率分别从52.0%提高至115%、45.0%提高至102%、40.0% ~ 50.0%提高至81.0% ~ 90.0%，其余化合物在不添加或添加10%丙三醇－甲醇的情况下均保持较稳定的回收率（96.0% ~ 112%）。GYM和SPX1的回收率提高可能是由于它们的螺亚胺结构和性质，丙三醇混合物可以增强酶促糖化和氨的回收［29］。因此，选择在洗脱液中添加100 µL的10%丙三醇－甲醇进行后续优化，此时各藻毒素的回收率达到稳定。

图3 10%丙三醇－甲醇溶液加入量对18种藻毒素回收率的影响（n = 3）Fig.3 Effects of volume of 10% glycerol－methanol on the recoveries of 18 phycotoxins（n = 3）

2.3 分析方法评价

2.3.1 基质效应由于样品中存在各种干扰物质（如色素、脂质等），在进行UPLC－MS/MS分析时会引起基质效应。有效的前处理方法可降低基质效应，从而避免样品中目标化合物的检出结果偏低或偏高。采用经“1.4”方法处理后的空白海水、悬浮颗粒物及沉积物样品提取液，配制18种藻毒素的混合标准溶液，以80%甲醇水配制相同浓度的标准溶液，分别采用本方法进行测定并绘制标准曲线，按照下式计算基质效应（ME）：ME =kmatrix/kstandard。式中，kmatrix为空白提取液配制藻毒素混合标准溶液中单个目标物的曲线斜率；kstandard为以80%甲醇水配制相同浓度的标准溶液中对应单个目标物的曲线斜率。结果表明，海水、悬浮颗粒物及沉积物对18种藻毒素有不同程度的基质抑制（ME < 1）和增强（ME > 1）作用，并在可接受范围内（0.80 ~ 1.20），其在海水、悬浮颗粒物及沉积物中的ME分别为0.81 ~ 1.23、0.80 ~ 1.16及0.88 ~ 1.16（表2）。

表2 18种藻毒素的线性范围、相关系数、检出限、定量下限以及基质效应Table 2 Linear ranges，correlation coefficients（r2），LODs，LOQs and matrix effects for 18 phycotoxins

（续表2）

2.3.2 线性范围、检出限与定量下限以80%甲醇水配制质量浓度分别为0.0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.0、2.0、5.0、10、20、50 ng/mL的标准样品溶液，采用本方法进行测定，外标法定量，并以18种藻毒素的定量离子峰面积对其质量浓度进行线性回归；分别根据3倍和10倍信噪比确定方法检出限（LOD）和定量下限（LOQ）。表2结果表明，18种藻毒素的相关系数（r2）为0.991 1 ~ 0.999 9，检出限为0.015 ~ 75 pg/L（或pg/g），定量下限为0.05 ~ 250 pg/L（或pg/g）。

2.3.3 回收率与相对标准偏差采用三水平六平行的加标回收实验考察方法的准确性和可靠性。在空白海水、悬浮颗粒物及沉积物样品中分别添加18种藻毒素混合标准溶液，加标水平为0.20、1.0、5.0 ng/L（或ng/g），采用本方法进行测定。结果显示，18种藻毒素的回收率为77.4% ~ 119%，相对标准偏差（RSD）为1.1% ~ 15%（表3）。表明本方法的准确度和精密度良好，能满足实际海水、悬浮颗粒物及沉积物样品中18种藻毒素的测定要求。

表3 海水、悬浮颗粒物及沉积物中18种藻毒素的平均加标回收率及相对标准偏差Table 3 Mean spiked recoveries and RSDs of 18 phycotoxins in seawater，suspended particulate matter and sediment

2.4 实际样品检测

采用建立的方法对深圳珠江口海域28个站点的海水、悬浮颗粒物及沉积物样品进行18种目标藻毒素的分析。样品中共检出10种藻毒素，包括AZA1、AZA2、AZA3、DTX1、DTX2、GYM、homoYTX、MTX3、OA及PTX2（表4）。海水样品中最主要的检出毒素为PTX2（平均值为4 220 pg/L），而悬浮颗粒物及沉积物样品中最主要的检出毒素为homoYTX（平均值分别为27.7 ng/g （dw）和77.6 pg/g （dw）），并在中国海水及沉积物中首次检出MTX3。珠江口海域中藻毒素的污染情况与大亚湾海域相似，且PTX2的浓度水平相当（1 190 ~ 5 970 pg/L）［16］，但珠江口悬浮颗粒物中PTX2的最高含量（199 ng/g （dw））高于青岛海域悬浮颗粒物中PTX2的水平（最大值：790 pg/g （dw）；仅PTX2被检出）［17］。

表4 海水、悬浮颗粒物及沉积物样品中藻毒素的检测结果Table 4 Detection results of phycotoxins in seawater，suspended particulate matter and sediment samples

（续表4）

3 结 论

本研究建立了同时测定海水、悬浮颗粒物及沉积物中18种典型藻毒素的UPLC－MS/MS方法。本方法简单快捷，灵敏度和精密度高，回收率良好，能够满足实际样品中18种目标藻毒素同时测定的要求。采用本方法对采自深圳珠江口28个站点的海水、悬浮颗粒物及沉积物样品进行检测，共检出10种藻毒素，说明珠江口海洋环境中分布着藻毒素，并首次在中国海水及沉积物中检出MTX3。