鸡肉中尼卡巴嗪残留基体标准样品的研制

林永健，徐敦明，沈鹭英，刘正才，李雨哲，王 伟，肖 晶

（1.福建农林大学 食品科学学院，福建 福州 350002；2.厦门海关技术中心，福建 厦门 361026；3.福州海关技术中心，福建 福州 350001；4.国家食品安全风险评估中心，北京 100022）

尼卡巴嗪是一种于1955年合成的抗球虫药，为4，4′-二硝基均二脲（4，4′-Dinitrocarbanilide，DNC）和2-羟基-4，6二甲嘧啶（2-Hydroxy-4，6-dimethyl-pyrimidine，HDP）的复合物，由于性能优良、高效，至今仍是肉鸡生产商在肉鸡饲料中使用的最有效产品之一［1－2］。HDP具有亲水性，在动物体内会随着尿液排出，代谢迅速；而DNC的水溶性小于0.02 mg·L−1，需通过粪便排出，代谢缓慢［3］，不能完全代谢排出体外，因而会残留在肌肉及其他组织中，人们食用该食物后会产生潜在危害［4］。因消费者更容易接触到DNC，欧洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）建议以DNC单体作为尼卡巴嗪的残留标识物［5］。许多国家和地区对鸡肉中尼卡巴嗪的最高残留限量（Maximum residue limit，MRL）进行了规定，我国规定鸡组织中尼卡巴嗪的MRL为200 µg·kg−1，国际食品法典委员会规定鸡组织中其MRL为200 µg·kg−1，美国和欧盟规定鸡组织中其MRL为4 000 µg·kg−1［6－8］。

标准样品（RM）是一种性质均匀且稳定，具有一种或多种特性值可满足测量使用的材料，可用于校准设备、评价测量方法或给材料赋值［9］。基体标准样品是具有实际样品特性的标准样品，由目标基体与目标化合物相结合，与实际检测样品更为一致，在分析中可有效避免基体效应对目标成分分析的影响［10］。标准样品作为实物标准，与相关国家文本标准配合使用，能有效实施国家文本标准，提高测量的准确性和产品质量。为满足相关检测的需要，开展相关基体标准样品的研制工作十分必要［11］。近年来各国对食品安全检测标准样品高度重视，尤其是与实际检测样品相接近的基体标准样品［12］。我国的文本标准相对完善，但实物标准的种类和数量尚不能满足需求。目前，以鸡肉为基体已成功研制了妥曲珠利及妥曲珠利砜、金刚烷胺和利巴韦林、硝基呋喃类等兽药残留基体标准样品［13－15］。通过查询国内外标准样品信息数据库，未见与尼卡巴嗪相关的标准样品。为填补我国尼卡巴嗪药物残留基体标准样品的空白，本文从动物喂药到结果定值进行探讨，研制出含尼卡巴嗪的鸡肉基体标准样品。该方法操作简单、稳定可靠，可为后续开展兽药残留基体标准样品的研制工作提供参考。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

实验用白羽肉鸡由福建圣农发展股份有限公司提供，体质量约1 kg；实验用药为市售尼卡巴嗪原药粉（含量≥ 98%，山东鲁西兽药股份有限公司）。

乙腈、甲醇、正己烷（均为色谱纯，德国Merck公司）；无水硫酸钠、二甲基甲酰胺、乙酸铵（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；尼卡巴嗪标准品（纯度≥ 98.5%）购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；同位素内标尼卡巴嗪－D8（纯度≥ 99.0%）购自德国Merck公司。

1.2 仪器与设备

API 6500液相色谱－串联质谱仪（美国Applied Biosystems公司）；高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；YQ－6电动肉丸机（佛山俊凌厨具电器厂）；Stomacher 3500型拍击均质器（英国Seward公司）；分析天平（上海衡际公司）；涡旋振荡器（德国IKA公司）；60Co－γ－射线辐照装置（福建省康普顿公司）。

1.3 尼卡巴嗪阳性样品的制备

为获得预期浓度的尼卡巴嗪自然代谢鸡肉样品，需通过预实验获得最佳制备条件。由于肉糜的均匀性和稳定性不足，需将鸡肉样品制成冻干粉，利用辐照灭菌有效降低微生物对样品稳定性的影响。

样品制备的流程如图1所示。按每1 kg饲料混合0.15 g尼卡巴嗪，对实验白羽鸡进行饲料口服喂药，每天给药1次，连续给药3天。尼卡巴嗪在鸡体内代谢后，将鸡宰杀取前胸肉，使用电动肉丸机制成肉糜；将肉糜放入拍击均质器中，以150 ~ 200次/min的频率拍击5 ~ 10 min，反复拍击3次，从不同位置随机抽取5份肉糜样品进行均匀性初检，确定样品满足均匀条件后，将肉糜冷冻干燥，并粉碎过筛，筛孔尺寸为0.425 mm（35目）；用铝箔袋抽真空包装鸡肉冻干粉，每袋约6 ~ 10 g，贴上编号标签；以12 kGy的60Co－γ－射线进行辐照灭菌后，保存于−18 ℃冰箱中，以备均匀性和稳定性评估。

图1 样品制备的流程图Fig.1 Flow chart for sample preparation

1.4 分析方法

1.4.1 样品前处理参考GB 29690－2013国家标准［16］检测样品中的尼卡巴嗪，同位素内标法定量。该标准通过中国合格评定国家认可委员会（CNAS）或中国计量认证（CMA）认可，适用的检测范围涵盖各种动物源基质，对准确度、重复性、重现性均进行了验证，使用有证标准物质进行外标定量和内标定量均是目前公认的进行兽药残留检测可靠准确的定量方法，可保证结果溯源的有效性。

1.4.2液相色谱条件色谱柱：Kinetex®（3.0 mm × 50 mm，2.6 µm）；流动相：A相为水，B相为乙腈；柱温为30 ℃；进样量为2 µL；流速为0.4 mL/min。梯度洗脱条件：0 ~ 2.00 min，10% B；2.00 ~ 2.10 min，10% ~ 50% B；2.10 ~ 3.50 min，50% ~ 80% B；3.50 ~ 7.00 min，80% B；7.00 ~ 7.01 min，80% ~ 10% B；7.01 ~ 10.0 min，10% B。

1.4.3 质谱条件多反应监测（MRM）扫描模式；电喷雾离子源（ESI）；负离子扫描；离子化电压（IS）：−4 500 V；气帘气（CUR）压力：241 kPa（氮气）；离子源温度（TEM）：500 ℃；雾化气压力：276 kPa；辅助加热气压力：276 kPa。尼卡巴嗪与内标的质谱参数见表1。

表1 尼卡巴嗪与内标的主要质谱参数Table 1 MS/MS parameters of nicarbazin and its internal

1.5 均匀性评估

均匀性是标准样品研制过程中必须保证的属性，会影响最小取样量和特性值的准确性。根据GB/T 15000.3－2008标准样品工作导则（3）－标准样品定值的一般原则和统计方法［17］，随机抽取15份样品，每份样品抽取3份子样进行测定，共45组数据。使用单因素方差分析法对均匀性数据进行处理，从而判断样品的均匀性。

1.6 稳定性评估

稳定性也是标准样品研制过程中必须保证的属性，包括短期稳定性和长期稳定性。短期稳定性是评估样品在极端运输温度和实验室搬运条件下保持特性值稳定的能力；长期稳定性是评估标准样品在生产者规定贮存条件下保持特性值稳定的时间，是标准样品有效期的重要依据。

1.6.1 短期稳定性研究为评估标准样品在极端条件下的稳定性，取独立包装的鸡肉粉分别置于−70、4、25、50 ℃条件下，保存14 天后开袋测定，每袋抽取3份子样进行测定，采用F-检验法对短期稳定性测定结果进行分析。

1.6.2 长期稳定性研究为评估标准样品的有效期，将样品长期保存于−18 ℃冰箱中，分别在第0、1、2、4、6、9、12个月从冰箱中取出2袋样品，每袋抽取3份子样进行测定。使用t检验对长期稳定性测定结果进行统计分析。

1.7 定值与不确定度分析

本批标准样品采用协同定值的方式，邀请8家在食品兽药残留检测领域具有资质的实验室（分别编号01 ~ 08），通过快递邮寄（包装盒中带有冰块），每个实验室分发3份样品，每份样品抽取2份子样进行测定。回收结果后，对8家实验室的定值结果进行正态分布分析和离群值检验，依次采用夏皮洛－威尔克（Shapiro－Wilk）检验、柯克伦（Cochran）检验、格拉布斯（Grubbs）检验。由于采用快递分发样品，短期运输所引起的不确定度已包含在各实验室的检测值中，不再单独计算。故不确定度包括定值标准不确定度uchar、均匀性检验的不确定度ubb和长期稳定性标准不确定度ults。

2 结果与讨论

2.1 药物代谢预实验

按每1 kg饲料混合0.15 g尼卡巴嗪，对实验白羽鸡进行饲料口服喂药，每天给药1次，连续给药3天。停药后第1天至第10天，每日宰杀2只白羽鸡取样，测定尼卡巴嗪残留量。图2表明，在停止喂药后的第4天，鸡肉中尼卡巴嗪的含量趋于稳定，并达到预期浓度水平。因此，阳性样品的采集选择在停药后的第4天。

图2 给药后鸡肉中尼卡巴嗪残留量随时间的变化Fig.2 Changes of nicarbazin residues in chicken meat after drug application

2.2 样品的制备

选取体质量约1 kg的白羽肉鸡30只，根据预实验结果进行喂药实验，在停药后的第4天采集阳性样品。使用电动肉丸机与拍击均质器将样品制成均匀肉糜，经过冷冻干燥、粉碎、过筛、真空包装，制备了355份独立包装的标准样品，贴上编号标签。以12 kGy的60Co－γ－射线进行辐照灭菌，辐照后样品按GB 4789.2－2016［18］测定细菌总数，检测值小于10 CFU/g。

2.3 样品的测定

样品测定前，需将鸡肉冻干粉恢复肉糜状态，通过测定冷冻干燥前后的样品含水量，确定以3倍冻干粉质量的水进行复水实验，同时考察了不同称样量（0.10、0.25、0.50 g）和不同复水时间（10、20、30、40 min）对检测结果的影响。按条件共设计12组实验，组1 ~ 4、组5 ~ 8、组9 ~ 12分别按称样量0.10、0.25、0.50 g在不同复水时长条件下进行分析，每组平行测定6次，计算每组的平均值与标准偏差（SD）。如图3所示，组11的测定值标准偏差最小且测定值符合预期，即称取0.5 g鸡肉冻干粉样品，加入1.5 g蒸馏水充分复水30 min，其分析结果的准确度和重现性最好，故后续实验采用该条件复水。

图3 复水条件分析结果Fig.3 Analysis results of rehydration conditions

样品按“1.4.1”前处理后与标准品上机检测，得到尼卡巴嗪标准品以及鸡肉冻干粉中尼卡巴嗪的选择离子监测色谱图。如图4所示，离子对的峰形良好，无杂峰干扰，且样品与标准品的保留时间一致，表明可以准确测定样品中的尼卡巴嗪。

图4 标准溶液（A）及样品（B）的选择离子监测色谱图Fig.4 Selected ion chromatograms of standard solution（A） and reference material（B）

2.4 均匀性检验结果

根据方差分析原理确定自由度（v1，v2），计算组内的均方差和组间的均方差，按方差检验给定的方法计算统计量F，查F分布表找出临界值F0.05（14，30），进行比较以判断标准样品的均匀性。检验结果如表2所示，F= 1.59

表2 尼卡巴嗪标准样品的均匀性检验结果（n = 3）Table 2 Homogeneity test results of nicarbazin reference material（n = 3）

2.5 稳定性检验结果

经过14 天的不同温度条件保存，样品未出现胀包、微生物腐败、样品变质等不正常状态。检测数据及分析结果如表3所示，在显著水平α= 0.05时，F=3.77

表3 标准样品的短期稳定性结果（n = 3）Table 3 Short term stability results of reference material（n = 3）

t检验法是计算回归参数b1（斜率）和b0（截距），通过误差分析计算b1的标准偏差s（b1）。采用s（b1）和t0.95，n－2的显著性判断样品的稳定性。表4为样品在第0、1、2、4、6、9、12个月的抽查检测结果与数据分析，查表得自由度n－2和p= 0.95（95%置信水平）的分布t因子为2.571，由于斜率变化的绝对值|b1|

表4 标准样品的长期稳定性结果（n = 6）Table 4 Long term stability results of reference material（n = 6）

2.6 定值与不确定度分析

2.6.1 定值本批标准样品邀请8家实验室定值，参加协同定值的实验室均通过了国家计量认证或中国国家合格评定委员会的认可并在有效周期内。定值实验室所用检测设备、计量器具均按照相关检定校准规程由计量部门进行检定或校准。定值结果如表5所示。回收的定值结果通过Shapiro－Wilk检验计算得W= 0.927 >W0.95（48）= 0.916，检测数据符合正态分布；通过Cochran检验计算统计量C= 0.190 4

表5 协同定值结果Table 5 Cooperative setting value

2.6.2 不确定度评估①测定值标准不确定度uchar：

测定值标准不确定度包括实验室检测环境、仪器条件、检测方法、检测人员不同等产生的不确定度，计算公式为：

其中：s为标准偏差，p代表实验室数，Yi为各实验室数据的平均值，Yˉ为总平均值。

②均匀性检验不确定度ubb：ubb=sbb。

其中：sbb为瓶间标准偏差，为瓶间方差，为瓶内方差，n为测量次数。

③长期稳定性标准不确定度ults：

本批标准品进行了为期12个月的长期稳定性检测（t= 12），采用直线为经验模型，在无显著降解的情况下，ults的计算公式为：ults=s（b1） ×t。

④扩展不确定度UCRM：

将数值代入公式，本批标准样品的不确定度结果如表6所示。在置信水平为95%（k= 2）时，扩展不确定度为11.0，最终确定标准值为（157.7 ±11.0） µg·kg−1（k= 2）。

表6 不确定度分析结果Table 6 Analysis results of uncertainty

3 结 论

通过模拟自然药物代谢残留过程，得到获取阳性鸡肉样品的最佳条件，制备了一批符合预期含量水平的鸡肉中尼卡巴嗪基体标准样品。该标准样品在进行鸡肉中尼卡巴嗪残留分析时，可用于校准仪器、确认和评价分析方法、考核检测人员技术水平等，也可用于保证食品分析量值溯源的有效性，为后续开展各类兽药残留基体标准样品的研制提供了参考。