激光诱导石墨烯/酶电极的葡萄糖传感研究

陈芳如，张兆康，2，何书涵，余羲溪，李艳霞*

（1.闽江学院 材料与化学工程学院，福建 福州 350108；2.福州大学 石油化工学院，福建 福州 350108）

随着社会的高速发展和人类文明的进步，人们的生活水平有了极大的提高。但是环境污染与快节奏生活也导致肥胖、亚健康人群的比例不断上升，诸如糖尿病、高血脂、心血管疾病、神经性疾病等严重影响了人们的日常生活。这些疾病的治疗通常不是一蹴而就，需要较长的调养过程，需要对病人情况进行日常监测。譬如糖尿病，目前尚未有彻底根治的方法，患者一般需要终身检测与治疗，以控制血糖范围，预防各类并发症。研究表明，人体的尿液、汗液、眼泪等生物流体的葡萄糖含量与体内血糖浓度存在关联，可用于糖尿病的血糖监测［3］。但使用传统方法检测患者的血液指标费时费力，给医院和患者带来了极大的不便，因此，对病患血糖水平的实时及非侵入式检测显得尤为重要［1］。

生物传感器是一种能将电化学传感和生物分子特异性识别相结合的传感装置，在当前实验室和临床分析各种化学和生物目标中起着关键作用。电化学传感器的最终目标是构建更加简便、灵敏和可靠的传感界面，进一步放大检测信号，提高灵敏度和准确度［2］。功能纳米材料和纳米技术的发展为改善电化学传感器性能提供了新的可能，寻找高性能电极材料是制备优异电化学传感器的关键。随着纳米材料对高性能的器件需求日益增加，可控微纳结构的研究成为热点之一［4］。可控微纳结构的制备，重点在于微纳加工技术的应用，使其朝着简化制备工艺、低成本和高重复性的方向发展，激光微加工的广泛应用，极大地提高了加工效率和重复性，为下一代智能健康检测提供了新思路。

石墨烯是一种单原子层的二维sp2杂化碳纳米片，由于其大比表面积、高电子迁移率、热导率、生物相容性、超低密度和机械柔性，从而表现出优异的理化性能，并在传感器、样品前处理和超级电容器等领域得到广泛应用［5－6］。激光诱导石墨烯（LIG）技术可诱导聚酰亚胺（PI）衬底直接生成三维多孔结构的石墨烯，表现出大比表面积和高导电性，制备过程无需高温和溶剂，在柔性电极制备中应用广泛［7－8］。另外，作为最典型的嵌入式系统，较小体积的微电极使得电化学分析便携、快速，更利于实际应用［9－10］。

葡萄糖氧化酶（GOx）因具有重要的催化活性而被广泛研究，其价格低廉，稳定性好，实用性强，也是制备酶传感器的理想模型分子［11］。鉴于酶的高选择性和高催化活性特点，目前GOx法是市场上使用最多的血糖检测方法，然而该工作的难点在于将酶固定在所需的平台上。GOx通常被固定在覆盖薄氟锡氧化物或铟锡氧化物、金或玻碳电极等刚性基底表面，阻碍了其在人体上的应用。LIG电极因其良好的物生物相容性，以及作为酶的良好环境和促进电子转移而被广泛开发［12］。电化学和激光相结合可为GOx在石墨烯基质中的共价键合以及GOx的电子转移提供良好环境，在葡萄糖监测方面显示出较好潜力，尤其在非侵入性和无痛性方面［13］。本文通过设计三电极图案，结合LIG技术制备微型柔性石墨烯电极，利用1−芘丁酸的疏水端苯环与石墨烯的六元环结构的π－π叠加效应，对LIG电极表面工作区域羧基化，进而共价交联GOx，通过采用便携式电化学工作站、计时电流分析法，记录在恒定电压下GOx催化葡萄糖产生的电流信号与葡萄糖浓度的关系，所制备的酶电极可用于人体血清、尿样和汗液的葡萄糖检测，从而构建了基于GOx的高灵敏、高选择葡萄糖传感，进一步推进便携、绿色、低成本生物传感器的研制。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Nano Pro－Ⅲ型激光打印机，配连续半导体激光器，波长450 nm，输出功率5.5 W（天津嘉银纳米科技有限公司）用于LIG电极制备；便携式电化学工作站（sensit/BT，雷迪美特中国有限公司）。

聚酰亚胺（PI）膜（厚度0.08 µm，天津嘉银纳米科技有限公司）；导电银浆（深圳市奥斯邦股份有限公司）；Ag/AgCl浆（广州市银标贸易有限公司）；氯化钾（99.5）、铁氰化钾（99.5）、亚铁氰化钾（99.5）、葡萄糖（分析纯）、50%戊二醛（福州鑫裕华实验仪器有限公司）；葡萄糖氧化酶（GOx，150 U/mg）、人工汗液、人工尿液、胎牛血清（源叶生物科技有限公司）；1-芘丁酸（上海麦克林生化科技股份有限公司，98%）、牛血清白蛋白（BSA，98.0%）、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS，0.1 mol/L，pH 7.0）（北京鼎国生物科技有限公司）。

1.2 电极的制备

1.2.1LIG电极的制备 将PI膜紧密粘贴于PET柔性基底上，Nano Pro－Ⅲ激光打印机与电脑连接，设计三电极图案，设置激光相对强度为35%，雕刻深度为20%，激光打印石墨烯图案，打印的电极依次用乙醇、水淋洗，室温晾干。在石墨烯尾部（三电极端头）涂上导电银浆，参比电极末端涂上Ag/AgCl浆，聚二甲基硅氧烷（PDMS）固定工作区域面积，放入培养皿中盖好，静置，固化，得LIG电极，待用。

1.2.2LIG/芘丁酸电极的制备 于LIG电极工作区域，滴加3 µL 5 mmol/L 1-芘丁酸（简写为芘丁酸）的乙酸溶液，均匀分散，静置1 h，依次用乙酸、乙醇、水淋洗电极，室温下晾干，得到LIG/芘丁酸电极，使电极表面羧基化。

1.2.3LIG/GOx电极的制备 配制质量浓度为4 mg/mL GOx和2 mg/mL BSA的PBS溶液（0.1 mol/L，pH 7.0），作为GOx溶液。于LIG/芘丁酸电极工作区域，先用2 µL乙醇浸润，半干（减小表面张力），再滴加10 µL GOx −0.5%戊二醛混合溶液（7∶3，体积比），4 ℃活化过夜，纯水淋洗，晾干备用，制得LIG/GOx电极，于培养皿中密闭，储于冰箱备用。

1.3 葡萄糖电化学传感分析

取所制备的LIG/GOx电极，从低到高移取100 µL系列浓度葡萄糖溶液，对电极进行i~t扫描。每次更换溶液，需要用高一级浓度的溶液润洗电极3遍，恒定0.7 V电位下进行扫描，每个浓度计时80 s，得i~t曲线。

2 结果与讨论

2.1 电极制备及葡萄糖传感

LIG/GOx电极制备及葡萄糖传感分析过程示意图如图1所示，具体过程包括：A：激光直写三电极图案化石墨烯；B：制备LIG电极；C：自组装1-芘丁酸；D：戊二醛共价键合GOx；E：计时电流分析。

图1 葡萄糖传感分析示意图Fig.1 Schematic of glucose sensing analysis

在室温条件下使用连续半导体激光器，将聚酰亚胺（PI）衬底改性为具有高导电性的三维多孔石墨烯结构［14］，无需使用高温工艺、溶剂或后续处理。其基本原理是通过激光照射，将sp3碳原子光热转化为sp2碳原子［15］。激光照射产生的能量导致晶格振动，产生较高的局域温度，从而破坏碳氧键、碳氧键和氮碳键，芳香族化合物重新排列形成多层石墨结构。结合图案化设计，可制备特定图案的石墨烯电极。芘丁酸疏水端的4个苯环相连的芘结构，与石墨烯的碳六元环结构通过π－π叠加效应，稳定结合在石墨烯电极表面，另一端的亲水端羧基通过戊二醛共价交联葡萄糖氧化酶，经BSA封闭，得到LIG/GOx电极［16－18］。

2.2 电极材料的表征

采用扫描电子显微镜（SEM）对LIG和LIG/芘丁酸复合电极进行表征（图2）。可观察到LIG电极表面呈现3D介孔的空间网状结构，且分散均匀、质地紧密（图2A），表明石墨烯电极具有较大的比表面积。LIG/GOx复合电极（图2B）仍然保留完整的介孔结构，说明在GOx修饰过程中，电极表面形貌未被破坏，同时石墨烯膜层增厚，表明石墨烯表面富含的羧基通过与戊二醛共价交联，将葡萄糖氧化酶成功固定到电极上。用透射电子显微镜（TEM）对激光直接制备的石墨烯纳米材料进行表征，可观察到石墨烯的多层片状结构（图2C）及LIG薄片的波纹状结构以及晶格条纹（图2D），这些波纹结构的形成归因于激光辐射产生的表面热膨胀，证明采用本方法的激光诱导技术，可一步生成石墨烯。

图2 LIG电极（A）和LIG/GOx复合电极（B）的SEM图及LIG石墨烯材料的TEM图（C、D）Fig.2 SEM images of graphene electrode（A） and LIG/GOx composite electrode（B） and TEM images of LIG graphene materials（C，D）

采用EDS光谱分析LIG和LIG/GOx复合电极表面的C、N、O元素成分。图3A所示，LIG电极表面C、N、O元素的相对含量分别为93.22%、1.44%和5.34%，说明LIG电极表面主要由C组成，含极少量的N和O，修饰GOx后（图3B），C、N和O元素的含量分别为88.32%、4.92%和6.76%，其O含量明显增加，这是由于GOx富含氧元素，证明GOx成功修饰到LIG电极表面。

为进一步表征电极表面GOx的共价修饰情况，采用Nicolet is50红外光谱仪，将样品压在衰减全反射ATR附件上，对LIG和LIG/GOx电极工作区域界面进行红外全反射光谱分析。结果如图3C所示，LIG电极表面未见明显红外吸收峰，而LIG/GOx电极表面可观察到许多特征红外吸收峰，其中3 287 cm−1处对应O—H、N—H伸缩振动，2 930 cm−1处对应饱和碳上的C—H伸缩振动，1 314 cm−1附近指纹峰对应饱和碳上的C—H面内弯曲振动，1 640 cm−1处对应酰胺键的伸缩振动，1 142 cm−1对应C—O—C（酯）的反对称伸缩振动，1 081、1 002 cm−1处对应C—O键的伸缩振动，这些特征峰的出现，表明GOx已成功修饰至LIG电极表面。

进一步采用赛默飞DXR智能拉曼光谱仪对LIG的形成进行表征，结果如图3D所示。可观察到3个典型的石墨烯指纹振动峰，分别为1 575 cm−1处的G带、1 345 cm−1处的D带和2 679 cm−1处的2D带。D带和2D带分别为六方碳结构sp2杂化的初级面内振动和二阶面内振动，而G带则与sp2杂化的C—C键拉伸模式有关。D带和G带之间的强度比（ID/IG）接近1，表明石墨烯结构存在缺陷。

图3 LIG、LIG/GOx电极表面的EDS 光谱（A、B）与红外光谱（C），LIG石墨烯材料的拉曼光谱（D）Fig.3 EDS spectra（A，B） and infrared spectra（C） of LIG and LIG/GOx electrode surfaces，and Raman spectrum of LIG graphene materials（D）

2.3 电极的电化学活性

采用铁氰化钾溶液的循环伏安（CV）图观察电极的组装过程，从图4A可以看出，LIG电极有明显的氧化还原峰。当芘丁酸修饰LIG电极后，氧化峰正移，还原峰负移，响应电流明显下降，这是由于芘丁酸属于小分子基团，导电性能差，对电极表面的电子转移有明显的阻碍作用。LIG/GOx电极的峰电流进一步减小，表明GOx已成功修饰至电极表面。LIG/芘丁酸电极能充分固定GOx，促进GOx电活性中心与电极表面之间的电子转移，同时保留了GOx的生物活性，给予GOx直接进行电化学行为的微环境。GOx修饰的LIG电极的CV曲线图仍然具有较明显的氧化还原峰，说明LIG/GOx电极表面仍具有良好的导电性及电化学响应。

图4 LIG、LIG/芘丁酸、LIG/GOx滴加铁氰化钾溶液（A）及LIG、LIG/GOx滴加PBS和葡萄糖溶液（B）的循环伏安图Fig.4 Cyclic voltammograms of LIG，LIG/pyrene butyric acid，and LIG/GOx in potassium ferricyanide solution（A），LIG and LIG/GOx in PBS and glucose solution（B）

采用CV法进一步考察LIG、LIG/GOx电极在PBS和葡萄糖溶液中的电化学行为。由于GOx作为识别元件对葡萄糖具有较高的选择性，图4B显示LIG/GOx电极比LIG电极在葡萄糖溶液中具有更好的电化学响应，说明GOx在电化学反应过程中对葡萄糖起到了酶催化效果。

参照文献［19］，电极表面的有效面积（Aef）f可根据Randles－Sevcik方程计算：Ip=2.69 ×105Aeffn2/3D01/2C0ν1/2。式中，n指参与氧化还原过程中电子传递数（n= 1，K3［Fe（CN）6］溶液），D0指铁氰化钾溶液的扩散系数（0.673 × 10−5cm2/s），C0指氧化还原媒介质的体相浓度（5 × 10−6mol/cm3K3［Fe（CN）6］），v为电位扫描速率，Ip为氧化峰电流（A）。通过公式，结合图4A的CV曲线，计算出LIG、LIG/芘丁酸、LIG/GOx、LIG/GOx（BSA）电极的Aeff值依次为0.222、0.090、0.048、0.028 cm2，表明LIG电极经芘丁酸、GOx以及BSA修饰后，电极表面产生较大影响，其氧化还原峰电流逐步降低，有效面积逐步减小。

单位面积修饰物的负载量（Γ，mol/cm2）通过Faraday公式计算：Ip=nFQv( 4RT)=n2F2AΓv( 4RT)和Γ=Q(nFAeff)，式中，Q为CV曲线的氧化峰面积积分，R为气体常数，T为溶液绝对温度，n指参与氧化还原过程中电子传递数（n= 1），F指法拉第常数（F = 96 493 C/mol）。通过公式和结合图4A，计算出LIG/芘丁酸，LIG/GOx电极表面修饰物质的Γ值分别为2.48 × 10−9、3.42 × 10−9mol/cm2，从而计算出被固定在电极表面单位面积GOx的数量为9.4 × 10−10mol/cm2。

2.4 电位对电流信号的影响

为比较葡萄糖氧化酶在不同电位的电化学响应，参考文献［18，20］并根据图4B的CV曲线，选择0.5、0.6、0.7 V 3个恒定电位进行比较。以PBS缓冲液作为基底液，在3个恒定电位下，每隔80 s依次从低到高对不同浓度的葡萄糖溶液进行计时电流扫描。结果显示，随着电压的增加，LIG/GOx电极对葡萄糖的灵敏度随之增加，且在0.7 V时对葡萄糖的电流响应最显著、灵敏度最高（图5A），其优异性可能与葡萄糖氧化酶的催化活性及稳定性有关。实验选择0.7 V作为LIG/GOx测试萄萄糖的最佳工作电位。

葡萄糖氧化酶在氧分子存在下能氧化葡萄糖生成D-葡萄糖内酯酸。图5B为经N2除氧和不除氧条件下，LIG/GOx对葡萄糖溶液的i~t曲线图。结果显示，不除氧条件下，LIG/GOx的计时电流信号随葡萄糖浓度的增加而显著增加，而脱氧情况下其计时电流变化不大，表明此时GOx对葡萄糖的生物电催化氧化效果不明显。据文献报道［21］，推测GOx在LIG/GOx电极表面可能发生如下电化学反应：

图5 LIG/GOx在不同电位（A）和脱氧环境下（B）对葡萄糖的i ~ t曲线图Fig.5 i－t curves of LIG/GOx in glucose solution at different potentials（A） and deoxygenation（B）glucose concentration（from left to right）：0，5.0 × 10−5，1.0 × 10−4，5.0 × 10−4，1.0 × 10−3，2.5 × 10−3，5.0 × 10−3，1.0 × 10−2 mol/L

即氧化态葡萄糖酶（GOx（FAD））将葡萄糖氧化为葡萄糖内酯酸，同时还原态酶GOx（FADH2）将溶液中氧气还原为过氧化氢。在含氧条件下，反应（1）和（2）同时发生；在脱氧条件下，具有生物活性的GOx（FAD）发生反应（1），GOx（FADH2）在修饰电极上发生直接电子转移反应（反应（3），这也是无氧条件下，计时电流具有一定信号响应，但信号强度随浓度变化不大的原因。

2.5 工作曲线

在0.7 V电位下，以PBS缓冲液作为基底液，每隔80 s对不同浓度（5.0 × 10−5、1.0 × 10−4、5.0 ×10−4、1.0 × 10−3、2.5 × 10−3、5.0 × 10−3、1.0 ×10−2mol/L）葡萄糖溶液依次进行扫描，采用计时电流法考察LIG、LIG/GOx电极对葡萄糖的响应（图6）。结果显示，与LIG相比，LIG/GOx对葡萄糖的响应迅速，且随着体系中葡萄糖浓度的增加，响应电流呈阶梯式增长，说明LIG/GOx电极对葡萄糖具有极高的亲和力和酶催化活性。

将不同浓度所得计时电流值与葡萄糖浓度对数作工作曲线（图6），可以看出：LIG/GOx的电流响应与葡萄糖浓度的对数呈指数关系，葡萄糖溶液检测的动态范围为5.0 × 10−5~ 1.0×10−2mol/L，其检测范围宽于常规血糖仪（罗氏卓越精采血糖仪的检测范围为0.6 ~ 33.3 mmol/L，三诺GA－3血糖仪的检测范围为1.1 ~ 33.3 mmol/L）。通过逐步降低葡萄糖溶液浓度，测得检出限（S/N= 2）为5.0 × 10−5mol/L。说明LIG/GOx电极对葡萄糖检测具有较灵敏的电流响应，而LIG电极对葡萄糖基本无响应，证明GOx在电化学反应中对葡萄糖起到定向催化作用。

图6 LIG、LIG/GOx电极对浓度葡萄糖溶液的i ~ t曲线图Fig.6 i－t curves of LIG and LIG/GOx in different glucose concentrations glucose concentration（from left to right）：0，5.0 × 10−5，1.0 × 10−4，5.0 × 10−4，1.0 × 10−3，2.5 × 10−3，5.0 × 10−3，1.0 × 10−2 mol/L；insert：the calibration curves

将本方法与几种报道的葡萄糖电化学生物传感器进行比较（见表1）。结果显示，本方法所构建的传感器具有较宽的检测范围和较好的灵敏度，且电极易于制备、环境友好、成本低廉，具有良好的应用前景。

表1 电化学葡萄糖传感方法的比较Table 1 The comparison of electrochemical sensor for detection of glucose

2.6 电极性能

选取浓度均为1 mmol/L的酒石酸、蔗糖、半乳糖、乳糖酸和葡萄糖等小分子样品，采用计时电流法分析其在修饰电极上的电化学响应情况。实验显示，只有葡萄糖表现出显著的电流响应，而酒石酸、蔗糖、半乳糖、乳糖酸等均表现出微弱的电流响应。表明半乳糖等干扰物对葡萄糖的检测干扰较小，LIG/GOx电极对葡萄糖传感具有良好的选择性。

在优化实验条件下，采用同一LIG/GOx电极连续测定5次，随着使用次数的增加，电流曲线呈缓慢下降趋势，但仍具有较好的电流强度，表明该LIG/GOx电极具有良好的重复性。

对同一批次5个LIG/GOx电极进行i ~ t扫描。结果表明，浓度为1.0 × 10−4、1.0 × 10−3、5.0 ×10−3mol/L的葡萄糖溶液的相对标准偏差（RSD）分别为7.7%、6.8%、5.0%，说明该LIG/GOx电极具有良好的精密度。

在相同条件下，将LIG/GOx电极在冰箱4 ℃下放置8 d，分别在第1、2、4、8 d进行测定，并记录i~t曲线。随着电极放置时间的延长，电流响应呈缓慢下降趋势，但仍有较好的电流表现，说明放置一定时间，GOx损失不显著，该LIG/GOx电极具有较好的稳定性和使用寿命。

2.7 LIG/GOx电极的柔性

考察了该电极在卷曲状态下的电化学性质。采用平铺和卷曲状态（图7内插图）下LIG/GOx电极对高、中、低3种浓度的葡萄糖溶液进行i~t曲线扫描（图7）。结果显示，两种状态下，i~t曲线接近重合，说明LIG/GOx电极在一定卷曲程度下，仍保留良好的电化学响应，卷曲后不影响使用［26］。表明所制备的LIG/GOx电极具备一定的柔性。

图7 柔性LIG/GOx电极在不同弯曲状态下的i ~ t曲线Fig.7 i－t curves of the flexible LIG/GOx electrode under different crimping conditions

2.8 实际样品的测定

选取用PBS稀释1倍的人工尿液、人工汗液，稀释20倍的胎牛血清的作为生物样品，分别添加低、中、高3种不同浓度的葡萄糖溶液，进行i ~ t扫描，并计算加标回收率。由表2可知，尿液、血清、汗液样品中葡萄糖的回收率依次为73.0% ~97.8%、103% ~ 144%、79.1% ~ 104%，其中血清样品的加标回收率偏高，但仍在可接受范围，说明本方法能较好地用于尿液、血清、汗液等生物样品中葡萄糖的检测。

表2 不同生物样品中葡萄糖的加标回收率Table 2 Spiked recoveries of glucose in different biological samples

3 结 论

本文采用LIG技术制备柔性LIG电极，通过GOx的共价修饰，构建了一种葡萄糖生物传感器。选择灵敏的计时电流法研究了葡萄糖在GOx修饰电极的电化学行为。结果表明，LIG/GOx电极在0.7 V恒定电位下，其响应电流在5.0 × 10−5~ 1.0 × 10−2mol/L范围内随葡萄糖浓度的增加而增加，对葡萄糖表现出较高的选择性和灵敏度，良好的稳定性和重复性，且具有一定柔性。基于LIG电极的葡萄糖检测成本低廉，操作简便，可用于实际样品分析，并赋予这类传感器的非临床和无创检测功能，同时也为葡萄糖的便携式检测开拓了新思路，具有很好的应用前景。