两类大戟二萜的高分辨ESI－MS/MS质谱裂解规律及诊断离子解析

王天山，付子卓，蒋方龙

（1.热带药用资源化学教育部重点实验室，海南 海口 571199；2.海南省热带药用植物化学重点实验室，海南 海口 571199；3.海南师范大学 化学与化工学院，海南 海口 571199）

大戟二萜是大戟属植物的主要化学成分，通常拥有比较丰富的二萜骨架和大环结构［1］。它们在植物化学、有机化学、药学和分子生物学方面都有非常重要的作用，但是曼西烷型（Myrsinane）和前曼西烷型（Premyrsinane）二萜等在植物中的含量较少，并已成为制约诸多相关研究发展的瓶颈。曼西烷型和前曼西烷型二萜主要存在于大戟科大戟属（Euphorbia）植物中，其基本化学结构是具有5/7/6/3和5/7/6多环骈合体系。根据该类物质的骨架转化和生源分析，前曼西烷型和曼西烷型二萜有直接的生源关系［2］。药理活性研究发现，此类二萜类化合物拥有非常广泛的生物活性，比如细胞毒性和抗肿瘤活性、抑菌活性、抗炎活性等，这为从大戟二萜中寻找药物先导物提供了数据依据［1，3］。随着一系列新的、高效的色谱技术与波谱技术的不断融合发展，新化合物和结构新颖的骨架不断被发现，丰富了大戟二萜的数据库。Yazdiniapour等［4］从伊朗产的E. gedrosiaca中发现两种新的曼西烷型二萜多酯化合物，并以紫杉醇作为阳性对照，研究了这些化合物在体外对小鼠黑色素瘤高转移细胞系B16F10和A375的增殖抑制活性。Flores－Giubi等［5］从大戟（E. boetica）全草的乙醇提取物中发现4类大戟二萜，其中3种是新的前曼西烷型二萜，2种是新的曼西烷型二萜，还有大环续随子二萜。这些大环续随子二萜可以促进小鼠体内的神经祖细胞（NPCs）增殖，具有修复受损脑细胞的意义。Laura等［6］采用高压液相色谱方法从意大利产的地衣大戟（E. myrsinites）中分离纯化制备出1种新的阿替生烷型、4种曼西烷型和3种巨大戟烷型大戟二萜，发现部分二萜对小鼠体外单核巨噬细胞J774A.1表现出一定的消炎活性。Huang等［7］从续随子（E. lathyrism）种子的95%乙醇提取物中发现两种高度重排的续随子烷型二萜Euphohyrismoinds A和B，两者分别具有独特的四环［10.2.2.01，10.03，7］十六烷和三环［8.4.1.03，7］十五烷型二萜骨架。Wang等［8］采用生源合成的方法发现，在室温下用三氟化硼－乙醚－乙酸乙酯体系催化大戟因子L1（续随子烷型二萜）可以合成曼西烷型二萜，阐明了这两类二萜可能的生物转化问题，并给出了合成曼西烷型二萜的化学方法，为其生物活性、构效关系和药理研究等提供了物质保障。

新化合物和新骨架的发现依托于研究方法的不断创新。近几年，有很多研究工作者借助GNPS（Global Natural Product Social Molecular Networking）数据库平台研究天然产物化学，主要是基于各种类型对照品的二级质谱（MS/MS）数据分析其二级质谱裂解规律和诊断离子，建立特定类型化合物的分子网络。通过此类分子网络不仅可以快速且大通量地鉴定中药的化学成分，挖掘新化合物，还可以为定向获取活性化合物提供重要的线索，为药物代谢研究提供新的方法［9－12］。宋少江课题组基于MS/MS的分子网络策略，从地胆草（ElephantopusscaberL.）中分离得到6种新吉玛烷型倍半萜内酯，分别命名为Scaberxones A－F；并发现Scaberxones F在10µmol/L时对脂多糖（LPS）诱导小胶质细胞（BV－2）释放一氧化氮（NO）的水平具有很强的抑制活性，并以此评估了其抗神经炎症活性［13］。张翠仙课题组采用超高效液相色谱－四极杆飞行时间质谱结合GNPS分子网络平台，对中药炮附片中二萜类生物碱的化学结构进行了快速表征，以13种附子对照品的二级质谱数据为基础建立GNPS网络，并结合这些对照品的质谱裂解规律成功鉴定了123个二萜类生物碱化合物，其中有34个化合物为潜在的新化合物［14］。

本研究采用高分辨电喷雾二级质谱技术（HR－ESI－MS/MS）分析两类15种大戟二萜的质谱裂解规律，阐述这些化合物的诊断离子，以期为此类二萜的质谱鉴定提供科学数据，并为利用分子网络技术定向分离此类物质提供必要的二级质谱数据和化学结构鉴定思路。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

Q Exactive Focus型四极杆高分辨质谱仪（美国Thermo Scientific有限公司），FA1604型电子天平（上海良平仪器仪表有限公司），XO－5200DB型超声波清洗仪（南京先欧仪器制造有限公司），MPC－5V406型医用药品冷藏箱（安徽中科都菱股份有限公司）；0.45 µm有机相过滤膜（天津津腾科技有限公司），色谱级甲醇（Marcon Fine Chemicals™有限公司），25%色谱级氨水（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），99.9%纯度液氮和99.99%纯度液氦（海口金厚特种气体有限公司）。

15种大戟二萜样品的化学名称分别为：Euphorprolitherin B（1），Euphordraculoin M（2），Euphordraculoin R（3），Proliferin A（4），Euphordracunculin A（5），Euphordracunculin B（6），Euphorbialoid F（7），Proliferin C（8），14-Deoxo-3β-O-prorionyl-5α，15β-di-O-acetyl-7β-O-nicotinoylmyrsinol-14β-acetate（9），Euphorbialoid C（10），Euphorbialoid D（11），3-Propanoate-5-benzoate-7，13，17-triacetate-premyrsinol（12），Euphorbialoid A（13），Falcatin S（14），Euphordraculoin K（15），由中国科学院昆明植物研究所王莉博士提供，化学结构见图1［15－18］。

图1 15种曼西烷型和前曼西烷型二萜的化学结构Fig.1 Chemical structures of fifteen myrsinane-type and premyrsinane-type diterpenes

1.2 质谱条件

Q Exactive Focus型质谱仪采用电喷雾离子源（ESI）结合TraceFinder数据分析软件（version 4.1）进行正/负离子模式扫描。扫描模式：Full MS/dd-MS2；Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率70 000，正离子模式喷雾电压：4.2 kV，负离子模式喷雾电压：4 kV，蠕动泵半自动进样速度：5 µL/min。离子传输管温度：350 ℃；鞘气压力：34.5 kPa；雾化温度：常温；MS/MS模式碰撞能量：10 ~ 50 eV（对各种测试样品进行手动优化，以获得丰富的子离子信号）。

1.3 待测样品溶液的配制

用天平称取各对照品1.0 mg，分别加入1 mL甲醇中超声溶解，再用0.45 µm微孔滤膜过滤，制备单一对照品储备液，置于药品储藏柜中4 ℃保存。测试时将1 mg/mL的储备溶液稀释至0.1 mg/mL。

2 结果与讨论

本研究选择的15种大戟二萜化合物，有9种曼西烷型二萜（1 ~ 9）和6种前曼西烷型二萜（10 ~ 15）。电喷雾质谱测试时发现部分样品的甲醇溶液未能检出［M + H］+的准分子离子峰，因此向未质子化的样品滴加1滴25%氨水进行氨化处理以获得［M + NH4］+的准分子离子峰，此准分子离子丢失中性NH3分子后与［M + H］+的ESI二级质谱裂解行为相同［19］。除［M + H］+/［M + NH4］+准分子离子峰外，实验中还观测到［M + Na］+和［M + K］+的准分子离子峰。在进行一级质谱和二级质谱扫描时，根据各化合物的分子量大小选择合适的扫描范围。本研究重点分析上述两类大戟二萜［M + H］+/［M + NH4］+准分子离子的质谱裂解规律，并结合各自的化学结构特点阐述其诊断离子。研究结果表明这些诊断离子主要集中在m/z200 ~ 320区间。

曼西烷型和前曼西烷型大戟二萜含有多个酰氧基，通过分析各化合物相同位置不同酰氧基的差异及其裂解顺序发现，酰氧基所受到的斥力大小以及是否含有β-H均会影响其质谱裂解顺序，一般斥力大的酰氧基更容易脱离，有β-H的酰氧基优先裂解。借助此类化合物的晶体结构或NOE（Nuclear overhauser enhancement spectroscopy）二维核磁共振实验数据更有利于理解各个酰氧基之间的相对位置和基团间的距离［5，8］。另外，通过分析这些化合物的［M + Na］+/［M + K］+的二级质谱还发现，最后一个酰氧基或羟基会与加合离子（Na+或K+）结合以羧酸盐或碱的方式脱离，且同一化合物不同形式的准分子离子在m/z200 ~ 320区间的裂解模式相同（表1）。

表1 4种代表性大戟二萜化合物的串联质谱碎片离子Table 1 Fragment ions of tandem mass spectrometry for four candidate Euphorbia diterpenoid compounds

（续表1）

2.1 曼西烷型二萜的二级质谱裂解

2.1.1 13，17-环氧-10，18-二氢曼西烷型化合物1 ~ 8的化学结构特点是拥有5/7/6/5四环体系，C-13和C-17通过氧桥键合形成一个四氢呋喃环，该四氢呋喃环表现出其裂解特点。化合物1 ~ 6在C-2的氧化位点为羟基或酰氧基，其它的氧化位点均为酰氧基。化合物Euphorprolitherin B（1）的氨化准分子离子m/z788 ［M + NH4］+受到轰击（10 eV）丢失一个中性NH3分子后，从C-2、C-5、C-7和C-15位连续丢失4个乙酸分子，随后C-3位（无β-H）的丙酰氧基与加合质子相结合断掉丙酸分子生成离子m/z457；而m/z353是比m/z457少104 Da的离子，归属为C-14位（无H+，无β-H）的苯甲酰基通过苯环2位氢的重排发生酰基裂解生成的醇式离子，继而其在C-10位丢失最后一个乙酸分子生成醇式二萜骨架离子m/z293。m/z293既可脱水生成m/z275离子，还可依次从四氢呋喃环和C-14位的羟亚甲基结构裂解掉两个中性小分子HCHO后生成m/z263和m/z233的离子对。相似的，经过C-10位丢失乙烯酮后得到的二醇式骨架离子m/z311相继裂解掉两分子甲醛得到另外一对离子m/z281和m/z251；实验还观察到离子m/z311从C-11位裂解掉一个丙酮分子生成m/z253。在碎片离子中m/z263→223相差40 Da，这归属为从C-11位丢掉一个丙炔分子（图2）。m/z311、281、251、293、263、233、275、253和223可视为是含有7个氧化位点且没有羰基的13，17-环氧-10，18-二氢曼西烷型二萜的诊断离子。

图2 化合物Euphorprolitherin B（1）氨化离子的质谱裂解途径Fig.2 Proposed fragmentation pathways of ammoniated euphorprolitherin B（1）

化合物Euphorbialoid F（7）只有6个氧化位点，比1 ~ 6在C-2少一个氧化位点，其中C-7被氧化成羰基，其它均为酰氧基。其二级质谱裂解表现为先丢失5分子羧酸，分别为丢失C-5、C-10和C-15位3分子乙酸生成m/z490，接着断裂C-3位丙酸得到m/z416，最后从C-14位经芳环上的氢重排断掉烟酰基生成醇酮式二萜骨架m/z311离子，或者直接脱掉烟酸得到m/z293酮式二萜骨架离子。若m/z416离子先从四氢呋喃环裂解掉甲醛分子将得到一个仅次于基峰的强离子信号m/z386，此离子也可断掉烟酰基或者烟酸生成m/z281和m/z263离子。酮式二萜骨架离子m/z293从C-7位丢失一个中性CO分子，再从C-11处断裂一分子丙烯分别得到m/z265和m/z223。m/z311-281-251离子簇的裂解模式与化合物1相同，均为丢失两个甲醛分子。离子m/z233的化学组成为C14H17O+3，根据其含有3个氧原子的特点推测可能是醇酮式二萜骨架离子m/z311的7元环开裂后产生的（图3红色箭头）。

图3 化合物Euphorbialoid F（7）质子化离子的质谱裂解途径Fig.3 Proposed fragmentation pathways of protonated euphorbialoid F（7）red arrow：m/z 233 ion obtained by seven-membered ring cleavage（红色箭头：七元环裂解生成m/z 233离子）

m/z293→265→223展示的是二萜骨架离子脱羰基和丙烯的过程，基本上能够反映该类物质的化学结构特点。m/z311、293、281、265、263、251、233和223离子反映了化合物7的四氢呋喃环、C-7羰基和C-11异丙烯基的裂解特点，可认为是此类化合物的诊断离子。

化合物7与1的骨架离子m/z293的化学组成相同，但其化学结构并不相同，主要区别在于7可以脱去CO分子（m/z293→265），而1则是脱水（m/z293→275）。还有一个很有意义的鉴别信息是，这两种化合物都含有m/z233的碎片离子，但是高分辨质谱提示其化学组成并不相同，前者为C14H17O3，后者为C18H17。这两组碎片离子的差异可以区分这些化合物在C-7位是否含有羰基。

2.1.2 5/7/6/5四环曼西烷型化合物9也是拥有5/7/6/5四环体系的曼西烷型二萜，与1 ~ 8的不同之处是其C-11位为异丙烯基结构。该化合物m/z654［M + H］+的二级质谱裂解是从C-3、C-5、C-7和C-15位脱酸后生成m/z337离子；该离子（m/z337）先从C-14位脱酸再从四氢呋喃环裂解掉甲醛即生成m/z277和m/z247的离子对，反之则生成m/z307和m/z247离子对；若从C-14位经过酰基上的氢重排脱去乙烯酮（CH2CO）则生成醇式二萜骨架m/z295离子。该m/z295离子具有与化合物1的醇式二萜骨架m/z293离子相似的裂解方式，既可脱水得到m/z277，也可从四氢呋喃环和C-14位的羟亚甲基依次裂解掉两个甲醛分子而生成m/z265和m/z235的离子对（图4）。由此可见，此类化合物的诊断离子为m/z295、277、265、247和235。

图4 化合物14-deoxo-3β-O-prorionyl-5α，15β-di-O-acetyl-7β-O-nicotinoyl-myrsinol-14β-acetate（9）质子化离子的质谱裂解途径Fig.4 Proposed fragmentation pathways of protonated 14-deoxo-3β-O-prorionyl-5α，15β-di-O-acetyl-7β-O-nicotinoyl-myrsinol-14β-acetate（9）

2.2 5/7/6/3四环前曼西烷型二萜的二级质谱裂解

前曼西烷型二萜的结构特点是比曼西烷型二萜在C环多一个偕二甲基环丙烷单元，形成5/7/6/3四环体系，其各个氧化位点的基团多为羟基、羰基和酰氧基。

以化合物Euphorbialoid C（10）为例对该类型化合物的质谱裂解途径进行分析，选择20 eV的碰撞能撞击［M + H］+可以得到比较丰富的二级质谱碎片离子。二级质谱图显示化合物10优先丢失5分子的羧酸：分别从C-7和C-13丢失两分子乙酸，从C-5丢失一分子苯甲酸，接着从C-3丢失一分子丙酸，最后从C-17（无β-H）经过H-9参与的裂解反应丢失一分子烟酸同时形成一个环丙烷单元，继而得到二萜骨架的醇酮式m/z295碎片离子（图5紫色箭头），若有一个酰氧基开裂即生成m/z313的骨架离子。这两个骨架离子既有常见的脱水和脱CO的特点，例如m/z295→277→249或者m/z295→267→249，也存在与曼西烷型二萜不同的裂解模式，即关于偕二甲基环丙烷单元的裂解。

通过分析相关碎片离子之间化学组成的变化发现，前曼西烷型二萜存在裂解掉丙烯的中性分子，这是由于经过前几步脱酸裂解后，偕二甲基环丙烷单元与碳碳双键相连致使三元环的张力进一步增大。离子m/z235和m/z225均比各自的前体离子减少42 Da，所对应的化学组成均为减少C3H6，裂解机理可能是三元环在C10－C11处开裂的同时一个H-20迁移至C-10，并在C-9处裂解掉一个C3H6丙烯分子（如图5红色箭头所示）。离子m/z253比m/z267少14 Da，从离子m/z267的结构看很可能是C-17处的三元环裂解掉CH2后生成双键，此双键可以与其它原有的双键形成更大的共轭体系；m/z253离子的存在说明H-9参与C-17处烟酰氧基的裂解并形成三元环（m/z418→295）的机理是合理的。

图5 化合物Euphorbialoid C（10）质子化离子的质谱裂解途径Fig.5 Proposed fragmentation pathways of protonated euphorbialoid C（10）red arrow： C3H6 loss； purple arrow： NicOH loss（红色箭头：丢失丙烯；紫色箭头：丢失烟酸）

碎片离子m/z313、295、277、267、253、249和225反映的是前曼西烷型二萜醇酮式骨架的裂解特征，而碎片离子m/z235和m/z225则反映了偕二甲基环丙烷单元的裂解特征。由于这些离子可反映该类型化合物的基本骨架，因此将其视为前曼西烷型二萜的诊断离子。

2.3 诊断离子解析

本文的15种大戟二萜均为多酯类化合物，含有多个氧化位点；酰氧基和羟基裂解后均可生成C= = C双键，所得到的子离子可相应地增加一个不饱和度。根据各类化合物潜在C= = C双键（pRDB值）和母核骨架不饱和度（bRDB值）的总数可以推测二萜骨架离子的质荷比；从裂解规律看，可以将酰氧基和羟基视为一个潜在的不饱和度，羰基有两个不饱和度（一个潜在不饱和度和一个双键不饱和度），而C= = C双键拥有一个不饱和度（见表2）。

表2 化合物1 ~ 15的潜在RDB值、骨架RDB值以及诊断离子Table 2 The potential RDB，backbone RDB values and diagnostic ions for 1－15

3 结 论

采用高分辨电喷雾质谱研究了大戟二萜中曼西烷型和前曼西烷型二萜的二级质谱裂解行为，并阐述了其诊断离子。通过研究15种样品的质谱裂解行为发现，在所有的氧化位点上酰氧基最容易脱酸，接下来是羟基脱水和羰基脱去CO分子。当化合物脱去所有的酰氧基后即可生成具有该二萜骨架的离子，以该离子作为母离子所生成的子离子可反映其化学结构特征，因此将这些二萜骨架离子视为诊断离子。对于10，18-二氢曼西烷型化合物（1 ~ 8），借助其诊断离子和碎片离子可以区分C-2位是否存在氧化位点以及是否存在羰基。这些诊断离子信息可为采用质谱技术快速鉴定同类型化合物提供可靠的数据参考，为建立大戟二萜的质谱分子网络提供必要的数据依据和研究思路。

由于所选择的样品种类和数量有限，此研究结果不一定代表所有曼西烷型和前曼西烷型二萜的质谱裂解行为。各个位点氧化态的不同、酰基之间斥力的不同或者存在其它桥环结构等因素都可能影响其质谱裂解方式。