整合素β2和Kindlin-2在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

刘苏雅 蒋文婷 任莹 高超

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是一种常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率和致死率均较高。因此，早期诊治对提高CRC患者的生存率至关重要。近来研究发现，整合素参与了肿瘤细胞的生长、浸润及转移[1]。整合素β2（integrin beta2 ，ITGB2）是整合素的一个亚组，它们具有共同的β2或CD18-chain，但有不同的α链和配体[2]。多项研究证实，ITGB2的异常升高在乳腺癌、骨肉瘤、胰腺癌的浸润与转移中发挥重要作用[3-5]。Kindlin家族是新近发现的一种黏着斑蛋白家族，它的3个成员Kindlin-1、Kindlin-2、Kindlin-3均包含4个FERM域（F0、F1、F2、F3），Kindlin-2和Kindlin-3的F3子域已被证明可与ITGB2和整合素β3尾部结合。Kindlin-2在造血系统外普遍表达，Kindlin-1主要在上皮细胞中表达，而Kindlin-3仅限于造血系统[6]。研究表明，Kindlin-1和Kindlin-3的功能丧失或突变导致与细胞黏附改变相关的疾病，而Kindlin-2的突变或变化水平与癌症有关[7]。Kindlin-2通过结合整合素β亚基胞内尾段，作用于一系列信号通路和转导因子，参与整合素活化，诱导肿瘤发生[8]。迄今为止，关于CRC中Kindlin-2调节ITGB2作用的报道很少。为此，本研究采用免疫组化法检测CRC组织中ITGB2和Kindlin-2的表达情况，并分析它们的表达与临床病理特征的关系，以期为CRC的诊治提供参考。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2021年6月至2022年2月徐州医科大学附属医院60例CRC患者手术切除的肿瘤组织标本及对应的癌旁（距肿瘤边缘≥5 cm）正常组织标本。所有患者术后病理诊断均为CRC，且均为初次就诊，临床资料齐全，术前均未接受放化疗、免疫治疗等，且不伴有其他恶性肿瘤。其中男35例，女25例；年龄46～87（67.33±9.97）岁；分化程度：高分化24例，中低分化36例；浸润深度：T1+T218例，T3+T442例；淋巴结转移25例，无淋巴结转移35例；按照美国癌症联合委员会TNM分期标准：TNMⅠ+Ⅱ期35例，TNMⅢ+Ⅳ期25例。本研究经徐州医科大学附属医院医学伦理委员会审批通过（批准文号：XYFY2022-KL261-01），所有患者均知情同意。

1.2 主要试剂 ITGB2抗体（批号：00069274）购自武汉三鹰生物技术有限公司；Kindlin-2抗体（批号：AI08141128）购自北京博奥森生物技术有限公司；组织脱水机（型号：Donatello）购自意大利DIAPATH公司；微波炉（型号：P70D20TL-P4）购自中国格兰仕微波炉电器有限公司；脱色摇床（型号：TSY-B）购自中国武汉Servicebio公司；显微镜（型号：E100）、成像系统（型号：Nikon DS-U3）均购自日本尼康公司。

1.3 CRC组织和癌旁正常组织中ITGB2和Kindlin-2表达检测 采用免疫组化法。制作4 mm厚的石蜡切片，常规脱蜡至水；置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液（pH 6.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复；3%双氧水溶液阻断内源性过氧化物酶；血清封闭；不同玻片上分别滴加ITGB2抗体和Kindlin-2抗体，4℃孵育过夜；洗涤后加二抗（HRP标记山羊抗兔抗体）、DAB显色、苏木素复染细胞核、脱水后封片胶封片。

1.4 结果判断标准 ITGB2阳性表达定位于细胞间质中，Kindlin-2阳性表达定位于细胞质，阳性表现为淡黄色至棕褐色颗粒。在光学显微镜下，每个标本随机抽取10个高倍视野（400×），根据免疫反应积分计分体系进行评分，即通过染色强度和染色范围来判定其结果。按染色强度评分：未见阳性染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。按染色范围评分：0%～5%为0分，＞5%～25%为1分，＞25%～50%为2分，＞50%为3分；染色强度得分×染色范围得分为总得分，总得分≤1分记为阴性，≥2分记为阳性。

1.5 统计学处理 采用SPSS 26.0统计软件。计数资料组间比较采用χ2检验；ITGB2与Kindlin-2蛋白表达的相关性分析采用Spearman等级相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRC组织和癌旁正常组织中ITGB2和Kindlin-2表达的比较 ITGB2阳性表达主要位于细胞间质中，Kindlin-2阳性表达主要位于细胞质，见图1。CRC组织中ITGB2阳性表达率为65.0%（39/60），高于癌旁正常组织的43.3%（26/60），差异有统计学意义（χ2=5.673，P＜0.05）。CRC组织中Kindlin-2阳性表达率为61.7%（37/60），高于癌旁正常组织的33.3%（20/60），差异有统计学意义（χ2=9.657，P＜0.01）。

图1 CRC组织和癌旁正常组织中ITGB2和Kindlin-2的表达（A：ITGB2在CRC组织中阳性表达；B：ITGB2在癌旁正常组织中阴性表达；C：Kindlin-2在CRC组织中阳性表达；D：Kindlin-2在癌旁正常组织中阴性表达）

2.2 CRC组织中ITGB2和Kindlin-2阳性表达与临床病理特征的关系 分化程度差、浸润深度深、TNM分期晚、有淋巴结转移的CRC组织中ITGB2和Kindlin-2阳性表达率分别高于分化程度好、浸润深度浅、TNM分期早、无淋巴结转移的CRC组织，差异均有统计学意义（均P＜0.05），而不同的性别、年龄、肿瘤直径CRC组织中ITGB2、Kindlin-2阳性表达率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 CRC组织中ITGB2和Kindlin-2的表达与临床病理特征的关系（例）

2.3 CRC组织中ITGB2和Kindlin-2表达的相关性分析 Spearman等级相关分析显示，CRC组织中ITGB2和Kindlin-2蛋白表达呈正相关（rs=0.356，P＜0.05），见表2。

表2 CRC组织中ITGB2和Kindlin-2蛋白表达的相关性分析（例）

3 讨论

CRC是世界上第3大常见的恶性肿瘤[9]，在中国恶性肿瘤的死亡率排名中位居第5[10]。随着诊疗技术的不断发展和新生物疗法的出现，CRC的发病率和死亡率有所下降，但整体却仍不容乐观。研究表明，早期CRC的5年生存率可达到90.0%，但绝大部分患者在确诊时已是中晚期[9，11]。因此，深入研究CRC的发病机制、筛选和发掘新的生物标志物，有助于提高CRC确诊率，延长患者生命，改善患者生命质量。

整合素是黏附分子五大家庭成员之一，它能与细胞外基质配体、细胞表面配体以及可溶性配体结合，进而改变整合素的表达、参与恶性肿瘤生物学行为[1]。ITGB2（包括 CD11a/CD18；CD11b/CD18；CD11c/CD18；and CD11d/CD18）最早是在白细胞黏附缺陷综合征的研究中被发现，随着研究的不断深入，发现其在肿瘤的发生和发展中起重要作用[12]。刘梦瑶等[13]通过构建ITGB2过表达质粒发现，相比于阴性对照组，过表达ITGB2后，人乳腺癌细胞的迁移、侵袭与黏附能力增高，这可能是由于ITGB2过表达导致局部黏着斑激酶（FAK）的磷酸化，影响其他细胞骨架蛋白（桩蛋白、张力蛋白），从而增加了细胞侵袭能力，使得乳腺癌细胞更易转移。Dai等[4]发现，长链非编码RNA ITGB2-AS1的下调抑制了Wnt/β-连环蛋白信号传导，降低了细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、C-myc基因等的表达水平，从而抑制骨肉瘤的增殖和转移。Benedicto等[14]通过小鼠CRC细胞实验发现，肿瘤细胞上ITGB2表达的减少与小鼠CRC细胞的增殖减慢和迁移减少有关。而人们对ITGB2在人类CRC中的确切作用知之甚少。为此，本研究利用免疫组化法对CRC及其癌旁正常组织ITGB2的表达进行了研究，结果表明，相较于癌旁正常组织，ITGB2在CRC组织中阳性表达率更高。同时，分化程度差、浸润深度深、TNM分期晚、有淋巴结转移的CRC组织中ITGB2阳性表达率分别高于分化程度好、浸润深度浅、TNM分期早、无淋巴结转移的CRC组织，差异均有统计学意义，提示ITGB2阳性表达可能对预测CRC的浸润转移起一定的作用。Kindlin-2作为整合素的激活剂参与肿瘤的发生，临床上与皮肤病发生、肿瘤侵袭、免疫系统功能关系密切[7]。踝蛋白（Talin）是最广为人知的ITGB2活化剂，然而，Montanez等[15]研究结果表明，Kindlin-2缺陷细胞无法激活整合素，而Kindlin-2是Talin诱导整合素激活所必须的，此外，他们还证明了Kindlin-2是整合素双向信号传导必不可少的元素。Kindlin活化整合素的机制可能有两个：（1）Kindlin家族利用F3结构域的磷酸化酪氨酸结合（PTB）位点，和整合素β亚基的细胞内段以及含酪氨酸的NxxY基序或NPxY基序结合，协同Talin活化整合素；（2）Kindlin也可以与Migfilin和整合素连接激酶结合，调整细胞骨架的肌动蛋白结构，促进细胞基质黏附[16]。除了Talin和Kindlin，整合素还与许多细胞质蛋白相互作用，例如丝蛋白A、Dokl1和14-3-3蛋白[17]。近年研究表明，Kindlin-2在许多恶性肿瘤中的表达上调，并影响肿瘤细胞的侵袭、耐药和转移[18]。Gozgit等[19]研究发现，Kindlin-2 在高侵袭性人乳腺癌细胞TMX2-28中高度表达，而且其表达量是低侵袭性乳腺癌细胞株MCF-7的17倍。此外，用小干扰RNA抑制Kindlin-2的表达显著降低了TMX2-28细胞的侵袭性，说明Kindlin-2可能在促进乳腺癌细胞侵袭方面发挥重要作用。但Shi等[20]得出了不同的结论，他们发现Kindlin-2在SK-LMS-1平滑肌肉瘤细胞系中大量表达，而在侵袭性更强的HT-1080纤维肉瘤细胞系中表达较低。因此，Kindlin-2的作用可能因癌症类型而异。本研究发现，CRC组织中Kindlin-2阳性表达率高于癌旁正常组织，差异有统计学意义。结合临床病理研究显示，相较于TNM分期早、无淋巴结转移的CRC组织，TNM分期晚、有淋巴结转移的CRC组织Kindlin-2的阳性表达率更高，这与王启船等[21]的研究结果一致。同时，本研究还发现，肿瘤浸润深度深、分化程度差的CRC组织中Kindlin-2阳性表达率高于浸润深度浅、分化程度好的CRC组织。这表明Kindlin-2的阳性表达与CRC的形成密切相关。

本研究还发现CRC组织中ITGB2和Kindlin-2表达呈正相关，并且ITGB2和Kindlin-2的表达与分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移密切相关。通过以上研究结果，笔者推测Kindlin-2通过上调ITGB2的表达水平，从而促进CRC的发病与进展，但这个推论仍需通过细胞实验加以证明。因此，未来笔者将通过增大样本量和增加实验研究深度，进一步探讨Kindlin-2和ITGB2在CRC发生、发展中的作用。