甘麦大枣复合饮料制备工艺及其抗疲劳功能研究

杨娜娜，吴迪，胡扬，韩晓宇，刘树森，孙文斌，綦峥，姚辛敏，徐蓓蕾※

（1.哈尔滨商业大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150076；2.北京双鹭药业有限公司 北京 100043；3.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150076）

疲劳是指当达到一定运动强度时，机体功能下降的一种状态[1]，常伴随着失眠、抑郁和注意力无法集中等症状[2]，近年来，抗疲劳产品开发已成为新的研究热点之一[3]。本研究旨在针对现代人群开发出的一款风味天然、成分健康及口感醇香的抗疲劳饮料。

甘麦大枣饮出自于《金匮要略》，处方比例为甘草150 g、大枣10枚、浮小麦1 L[4]，具有养神安神、益脾保肝和缓解疲劳之效[5]。方剂组成简单，且皆为药食同源类中药，能够治疗精神恍惚、抑郁，还可理气解忧、改善情绪和睡眠不安。现代研究表明，该方剂常被用于抑郁症、睡眠障碍、阿尔茨海默病及肠易激综合征的治疗[6-11]。故本研究以此方为基础，优化甘麦大枣药液提取工艺及其复合饮料的制备工艺，并对其抗疲劳、缓解抑郁功能进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂

甘草、浮小麦购买自安宁大药房，经哈尔滨商业大学药学院金哲雄教授鉴定为豆科植物甘草（Glycyrrhizae uralensis Fisch.）的干燥根和根茎；浮小麦为禾本科植物小麦（Triticum aestivum L.）的干燥轻浮果实；大枣购买于家乐福超市，经哈尔滨商业大学药学院金哲雄教授鉴定为鼠李科植物枣（Ziziphus zizyphus）的成熟果实。娃哈哈纯净水购买自杭州娃哈哈集团有限公司；山梨酸钾（分析纯，批号：20170118）购买于天津市光复精细化工研究所；白砂糖购买于汇源公司。

1.2 实验动物

ICR小鼠150只，体重30~40 g，雌雄各半，购买自黑龙江省佳木斯市多多药业（批号：S0567）。

1.3 实验仪器

DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱（上海-恒科技有限公司）；Leica（HI1210）水浴锅；ISO9001分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；LMS-2B型二道生理记录仪（北京仪器厂）；JZ-180手动界面张力仪（济南艾克斯工业测试系统有限公司）；WB35F型数码相机（三星公司）；DT001型电子体温计（倍尔康公司）；LD3100-1型天平（金钻计量仪器销售部），PHS-25酸度计（上海雷磁），LDZH-150L高温灭菌锅（上海申安医疗器械）。

2 实验方法与结果

2.1 工艺流程

取预处理后大枣、甘草、浮小麦按照比例混合→清洗、干燥、破碎→混合均匀→甘麦大枣药液提取→过滤→药液稀释→复合饮料调配→包装、灭菌→冷却→成品。

2.2 技术要点

准确称取原料，通过单因素试验及正交试验确定原料提取工艺，过滤药液，再通过单因素试验及正交试验确定药液稀释倍数、甜味剂、酸味剂及防腐剂添加量，将药液用纯净水稀释至相应倍数，向稀释后的药液中依序加入甜味剂及防腐剂，充分搅拌，确保搅拌均匀。过滤，得到颜色均匀澄清的橘黄色饮料，采用高温灭菌锅灭菌，趁热装罐，冷却至室温，检测其稳定性。

2.3 甘草、大枣和小麦的预处理

挑选无杂质、无霉变的甘草，清洗，60℃烘干后放入研钵中，破碎至2~4mm的甘草片段，精密称量6.8g。

挑选无杂质、无霉变和无虫蛀的圆润硕大的大枣原料10枚清洗（约20 g），60℃烘干后去核放入到研钵中，破碎，破碎程度同甘草。

挑选无杂质、无霉变的浮小麦原料，清洗，60℃烘干后放入到研钵中，破碎，破碎程度同甘草。精密称量11.3 g。

2.4 甘麦大枣药液提取工艺优化

2.4.1 提取时间、提取温度、提取次数及加水量的选择精密称取预处理后原料，混合均匀。提取条件为60℃下回流提取80 min（温控水浴锅调节药液提取温度），提取1次。依次考察提取时间、提取温度、提取次数及加水量对甘麦大枣药液出膏率及感官评分影响。考察因素及水平见表1。

表1 甘麦大枣药液提取单因素水平考察表Table 1 Investigation table of extraction factor level of Ganmai Jujube liquid medicine

2.4.2正交试验考察提取时间、提取次数以及提取温度对感官评分的影响根据单因素试验结果，将影响甘麦大枣药液提取主要因素提取次数设为A（1次、2次和3次）、提取时间设为B（30 min、60 min和90 min）、提取温度设为C（60℃、80℃和100℃）、加水量设为D（300 mL、400 mL和500 mL），采用L9（34）正交试验优化甘麦大枣药液最佳提取工艺。正交试验因素水平设计见表2。

表2 甘麦大枣药液提取正交试验因素水平考察表Table 2 Investigation table of orthogonal experimental factors for the extraction of Ganmai Jujube liquid medicine

2.5 甘麦大枣复合饮料制备工艺研究

2.5.1 药液稀释倍数、甜味剂添加量、防腐剂添加量的选择根据甘麦大枣药液最佳提取工艺优化结果进一步筛选甘麦大枣复合饮料制备工艺，考察药液稀释倍数、甜味剂添加量及防腐剂添加量对甘麦大枣复合饮料感官评分影响，单因素试验考察因素水平见表3。

表3 甘麦大枣复合饮料制备单因素水平考察表Table 3 Investigation table of the single factor level in the preparation of Ganmai Jujube compound beverage

2.5.2 正交试验考察最佳稀释倍数以及辅料添加量根据单因素试验结果，将甘麦大枣复合饮料制备工艺主要影响因素药液稀释倍数设为E（2倍、5倍和10倍），甜味剂添加量设为F（2%、3%和4%），防腐剂添加量设为G（0.1%、0.2%和0.3%），采用L9（34）正交试验优化甘麦大枣复合饮料制备工艺。正交试验因素水平设计见表4。

表4 甘麦大枣复合饮料制备正交试验因素水平考察表Table 4 Investigation table of orthogonal experimental factors for the preparation of the compound beverage of sweet wheat and jujube

2.5.3 感官评定标准感官评定由12人组成，从饮料外观性状、气味、色泽及滋味4方面进行感官评分，评分标准见表5，评分均值为感官评定的最终得分。

表5 感官评分标准Table 5 Sensory scoring standard

2.5.4 饮料稳定性测试观察甘麦大枣复合饮料50 d内外观性状变化，并每隔5 d测定其pH，评价其稳定性。

2.6 甘麦大枣复合饮料抗疲劳及抗抑郁研究

2.6.1 甘麦大枣复合饮料制备根据“2.4.1”及“2.4.2”实验结果制备甘麦大枣复合饮料，平行制备3组，设置1 g/kg、0.5 g/kg和0.25 g/kg 3个浓度组。

2.6.2 动物分组及给药将150只小鼠随机分为空白对照组、百忧解对照组、甘麦大枣饮高浓度组（1g/kg）、甘麦大枣饮中浓度组（0.5 g/kg）和甘麦大枣饮低浓度组（0.25 g/kg），每组30只小鼠。空白对照组小鼠灌胃给予纯净水；百忧解对照组小鼠灌胃给予百忧解；甘麦大枣饮料组分别灌胃给予高、中、低浓度的甘麦大枣饮料，灌胃剂量均为10 mL/（kg d），2次/d，连续5 d。在末次灌胃1 h后进行试验。

2.6.3 小鼠悬尾试验在离小鼠尾尖部大概1cm处用胶贴上丝线一端，丝线另一端连接二导记录仪的张力换能器，小鼠头部离台面约7 cm，保持室内温度恒定（25±1）℃。悬挂总时长为6 min，用二导记录仪记录2 min后小鼠累积不动时间。

2.6.4 小鼠强迫游泳试验将小鼠放入高135 cm、直径30cm的装满水的塑料桶内，保持水温恒定（24±1）℃，用数码相机记录下小鼠游泳的过程，总共6 min，记录2 min后小鼠累积不动时间。小鼠不再挣扎或漂浮于水面上，四肢轻微动作以保持头部能露出水面即可记录为不动时间。

2.6.5 拮抗利血平试验对小鼠腹腔注射利血平4 mg/kg，记录小鼠肛温、眼睑下垂率及小鼠出圈率。肛温：注射利血平4 h后，将电子体温计插入小鼠肛门内约1 cm左右，测量其肛温，记录温度，比较不同组之间肛温的差异。眼睑下垂：注射利血平1 h后，观察小鼠眼睑，并记录眼睑下垂个数，计算百分率（%）。出圈率：腹腔注射利血平1 h后，把小鼠放在直径8cm的圆圈内观察15 s，并记录各组的出圈小鼠数量，计算出圈率。

2.7 数据分析

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，所有数据以平均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 甘麦大枣提取工艺单因素考察结果

3.1.1 提取时间、提取温度、提取次数及加水量对甘麦大枣药液感官评分影响提取时间、提取温度、提取次数及加水量对甘麦大枣药液感官评分与出膏率影响分别见图1~4、图5~8，结果表明，当提取时间为60 min、提取温度为80℃、提取次数为3、加水量为300 mL时，甘麦大枣药液感官评分分别为76、78、88和83，出膏率分别为12.5%、11.8%、12.1%和10%。

图1 提取时间对甘麦大枣药液感官评分的影响Fig.1 Effect of the extraction time on the sensory score

图5 不同提取时间对甘麦大枣药液出膏率的影响Fig.5 Effect of the different extraction time on the extraction rate of Ganmai Jujube liquid medicine

图2 提取温度对对甘麦大枣药液感官评分的影响Fig.2 Effect of the extraction temperature on sensory score

图3 提取次数对对甘麦大枣药液感官评分的影响Fig.3 Effect of the extraction time on sensory score

图4 加水量对甘麦大枣药液感官评分的影响Fig.4 Effect of the water addition on the sensory score of Ganmai Jujube liquid medicine

图6 不同提取温度对甘麦大枣药液出膏的影响Fig.6 Effect of the different extraction temperature on the paste extraction of Ganmai Jujube liquid medicine

图7 不同提取次数对甘麦大枣药液出膏率的影响Fig.7 Effect of the different extraction time on the paste yield of Ganmai Jujube liquid medicine.

图8 不同加水量对甘麦大枣药液出膏率影响Fig.8 Effect of the different water addition on the paste yield of Ganmai Jujube liquid medicine

3.1.2正交试验考察提取因素结果由表6和表7可知，影响出膏率4个因素的主次关系为A＞B＞C＞D，影响感官评分4个因素主次关系为D＞B＞A＞C，比较了K1，K2，K3及k1、k2、k3值，综合两个正交试验结果及试验成本，确定甘麦大枣药液的提取优选工艺为A3B2C1D1，即加入300 mL水，60℃提取3次，每次60 min。

表6 甘麦大枣药液提取工艺正交试验结果Table 6 Orthogonal experimental results of the extraction technology of Ganmai Jujube liquid medicine

表7 提取工艺正交试验方差分析结果Table 7 Results of the variance analysis of the orthogonal test of the extraction process

3.2 甘麦大枣复合饮料制备工艺

3.2.1 单因素试验结果在确定甘麦大枣药液最佳提取工艺基础上进一步通过单因素试验及正交试验优化其制备工艺，对其最佳稀释倍数、甜味剂添加量及防腐剂添加量进行考察，结果见图9~11。结果表明，当药液稀释5倍、甜味剂添加量为3%、防腐剂添加量为0.2%时，甘麦大枣复合饮料颜色澄清均匀，味道酸甜可口，具有甘麦大枣的天然香气，沉淀周期适中，且沉淀物少。

图9 药液稀释倍数对甘麦大枣复合饮料感官评分影响Fig.9 Effect of the dilution ratio of the liquid medicine on the sensory score of Ganmai Jujube compound beverage

图10 甜味剂添加量对甘麦大枣复合饮料感官评分影响Fig.10 Effect of the sweetener addition on the sensory score of Ganmai Jujube compound beverage

图11 防腐剂添加量对甘麦大枣复合饮料感官评分影响Fig.11 Effect of the preservative addition on the sensory score of Ganmai Jujube compound beverage

3.2.2 酸味剂添加量选择的结果由于药液中带有大枣的原始酸味，在药液中添加不同含量的酸味剂，经过感官评分，对饮料未造成明显影响，所以本次试验希望保留原料的天然风味，暂不添加酸味剂。

3.2.3 甘麦大枣复合饮料制备工艺正交试验结果根据甘麦大枣复合饮料制备工艺单因素考察结果，进一步进行正交试验。正交试验及方差分析结果见表8和表9，结果表明甘麦大枣复合饮料最佳制备工艺为A2B2C1，即药液稀释倍数为5，甜味剂添加量为3%，防腐剂添加量为0.1%。由数据可知，影响感官评分的3个因素主次关系为A＞B＞C，即药液稀释倍数对饮料的感官评分具有显著性影响。

表8 甘麦大枣复合饮料制备工艺正交试验结果Table 8 Orthogonal test results of the preparation technology of the compound beverage of sweet wheat and jujube

表9 甘麦大枣复合饮料制备工艺正交试验方差分析结果Table 9 Results of ANOVA of the orthogonal Test on the preparation technology of Ganmai Jujube Compound Beverage

3.3 稳定性实验的结果

根据实验筛选出最佳制备工艺制成甘麦大枣复合饮料，测定其pH为6.23，且口感醇香，具有甘草、小麦和大枣的天然风味，酸甜适中，饮料呈均匀澄清的橘黄色。

50 d内每隔5 d测定其pH分别为6.14、6.35、6.22、6.19、6.05、6.28、6.37、6.22、6.08、6.23和6.12，且饮料无异味，无沉淀及悬浮物出现，色泽稳定无明显变化，证明该制备工艺制得的甘麦大枣复合饮料稳定性良好。

3.4 甘麦大枣复合饮料抗疲劳及抗抑郁作用研究

3.4.1 小鼠悬尾实验及强迫游泳实验结果小鼠悬尾实验及强迫游泳实验结果见表10和图12。实验结果表明，甘麦大枣复合饮料能够减少小鼠悬尾不动时间及游泳累积不动时间，均具有显著性差异，说明甘麦大枣复合饮料能够起到一定的抗疲劳作用。

表10 小鼠悬尾实验及强迫游泳实验（±）Table 10 Results of the mouse tail suspension experiment and the forced swimming experiment（ ±）

图12 小鼠悬尾不动时间及小鼠游泳累计不动时间Fig.12 Immobility time of the mouse tail suspension and the accumulative immobility time of the mouse swimming

3.4.2拮抗利血平试验的结果甘麦大枣饮料能够显著提高小鼠肛温及小鼠出圈率，降低利血平导致的小鼠眼睑下垂率。结果见表11和图13。

表11 小鼠肛温、眼睑下垂率及出圈率（±）Table 11 Anal temperature,blepharoptosis rate and out-of-loop rate of mice(±)

图13 甘麦大枣复合饮料拮抗利血平实验Fig.13 Experiment on the ntagonistic ffect of Ganmai Jujube ompound everage on eserpine

4 讨论

有研究表明，利血平可导致抑郁——一种中枢神经的不良反应[12]，作为治疗轻中度高血压的安定药，利血平作用效果缓慢，持续作用时间较长，能够消耗周围交感神经末梢的肾上腺素，抑制中枢神经系统，是一种阻断性抗高血压药。其能够产生镇静作用，但不会导致动物嗜睡及麻醉。低剂量注射后会导致动物出现眼睑下垂、瞳孔缩小及体温下降等抑郁症状，能够诱导动物抑郁模型，具有造模时间短、操作简便等优点。百忧解又名氟西汀[13]，其作为选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（selectiveserotoninreuptakeinhibitor,SSRIs）的代表药物[14]，目前已有大量研究证明其对抑郁症具有良好治疗作用[15-17]，故本研究选取百忧解作为对照药物，采用注射低剂量利血平诱导小鼠抑郁模型，并通过悬尾实验和强迫游泳实验建立压迫环境，使动物无法回避，产生“绝望扭曲行为”[18-20]，即不动状态，提高小鼠对抗抑郁药物敏感状态。该方法常用于抗疲劳、抗抑郁类研究。从实验结果中可看出，甘麦大枣饮料可以有效地缩短小鼠悬尾不动时间及小鼠游泳不动时间，使注射利血平组的小鼠肛温上升、眼睑下垂率降低及小鼠出圈率上升，说明甘麦大枣饮料具有一定的抗疲劳及缓解抑郁作用。

甘麦大枣汤方剂组成简单，且皆为药食同源类中药，现代研究表明，甘麦大枣汤具有宁心安神，缓急调脾之效[21]，其加减方常用于抑郁症治疗[22]。随着现代生活节奏加快，抑郁症患病率逐年上升[23]，患者常伴有疲劳、长时间情绪低落及情感障碍等症状，已经严重危害人们的身心健康，而甘麦大枣汤中浮小麦能够养心护肝，配以甘草和中缓急、大枣益心脾，既可补养心脾之虚，又可缓肝之急。目前对甘麦大枣汤的研究主要集中于其抗抑郁机制，并未见有相关保健饮料报道。本研究在确定甘麦大枣复合饮料制备工艺基础上，进一步研究该饮料抗疲劳、缓解抑郁功能。实验结果表明，甘麦大枣复合饮料制备工艺简单，风味天然，且具有一定的抗疲劳和缓解抑郁功能，为甘麦大枣汤的进一步开发利用提供了新思路。