芒果叶提取物体外抗HIV-1活性研究

王 倩， 叶 力， 王 捷， 周 波， 覃秋珍， 詹妤婕， 刘 欣， 刘 洁， 梁 浩

获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染引起机体免疫功能严重受损的重大传染性疾病，易导致机会性感染的发生[1-2]。据国家卫生健康委统计，2021年我国共报告新发AIDS 60 154例，死亡19 623例，报告死亡数居乙类传染病之首[3]，防治形势仍十分严峻。目前，高效抗逆转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy,HAART)是针对HIV/AIDS患者最有效的治疗手段，但在HAART治疗过程中易产生一系列不良反应[4]，且会出现耐药性[5]等问题，在一定程度上限制了患者治疗的依从性和临床疗效。我国有丰富的中草药资源，近30年来，中医药在缓解艾滋病患者HAART不良反应[6]、降低耐药风险[7]及促进机体免疫功能恢复[8]等方面取得了长足发展。芒果叶是漆树科芒果属植物MangiferaindicaL.的叶片，在我国广西、云南等地分布较广[9]。有研究显示，芒果叶提取物有广泛的生物活性，包括免疫调节、抗氧化等，其乙醇提取物能通过抑制淋巴细胞和巨噬细胞等的氧化应激来发挥免疫保护作用[10-12]。不少研究发现具有抗氧化作用的中草药物具有抗HIV-1功能[13-15]。鉴此，本研究通过TZM-bl-HIV-1ⅢB和MT-2-HIV-1ⅢB两种细胞-病毒感染模型探讨芒果叶乙醇提取物的抗HIV-1活性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1芒果叶提取物制备 芒果叶乙醇提取物由广西医科大学制药厂制备。制备方法：称取芒果叶100 g，加入30%乙醇1 000 ml，加热回流2 h，加热温度65～75 ℃。取残渣再重复提取2次，1.5 h/次，共提取3次。收集全部提取液过滤，滤液静置24 h，取上清液浓缩，浓缩温度60～75 ℃。真空度-0.05～-0.08 MPa。收集浓缩液进一步于65～75 ℃环境下干燥至浸膏，即得芒果叶提取物。

1.2细胞和病毒株 TZM-bl细胞、MT-2细胞及HIV-1ⅢB毒株均在本课题组实验室保存，病毒活性实验在广西医科大学生物安全三级(BSL-3)实验室开展，具备相关资质。

1.3主要实验试剂 DMEM高糖培养液、RPMI1640培养液、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和胰蛋白酶-EDTA(0.25%，含酚红)购自Gibco公司。1×PBS液(pH7.2～7.4)、100×青霉素-链霉素混合液购自Solarbio公司。CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability试剂、Bright-Glo Luciferase Assay试剂购自Promega公司。齐多夫定(azidothymidine，AZT)购自Sigma公司。

1.4仪器设备 生物安全柜(Thermo公司)、恒温CO2细胞培养箱(Thermo公司)、全功能酶标仪(BioTek，Synergy H1，美国BioTek公司)、普通倒置显微镜(日本Nikon公司)、全自动细胞成像仪(EVOSTMFL Auto 2 Imaging System，Thermo公司)等。

1.5三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)法测定芒果叶提取物的体外细胞毒性

1.5.1 TZM-bl细胞体外毒性实验 取调整浓度为1×105cells/ml的TZM-bl细胞接种至96孔板，细胞培养箱内培养24 h。实验组分别加入梯度稀释的芒果叶提取物(272.00 μg/ml、54.40 μg/ml、10.88 μg/ml、2.18 μg/ml、0.44 μg/ml、0.09 μg/ml、0.02 μg/ml)和AZT(10.00 μM、2.00 μM、0.40 μM、0.08 μM、0.016 μM、0.003 2 μM、0.000 64 μM)，对照组不加药物，只加入同体积DMEM培养液，每组设置3个重复孔。继续培养48 h后加入CellTiter-Glo®试剂，应用多功能酶标仪检测化学发光数值(RLU值)。相对细胞活性(%)=(实验孔发光数值-空白背景孔发光数值)/(细胞对照孔发光数值-空白背景孔发光数值)×100%。当相对细胞活性<80%时可认为药物存在细胞毒性。

1.5.2 MT-2细胞体外毒性实验 取调整浓度为2×105cells/ml的MT-2细胞接种至96孔板，采用1640培养液进行细胞培养，其余操作步骤同方法1.5.1。

1.6测定芒果叶提取物的体外抗HIV-1病毒活性

1.6.1 TZM-bl-HIV-1ⅢB细胞模型 取调整浓度为1×105cells/ml的TZM-bl细胞接种至96孔板，细胞培养箱内培养24 h后加入HIV-1ⅢB病毒稀释液(MOI=0.01)以及梯度浓度的芒果叶提取物和AZT，阳性对照组仅加入病毒稀释液，阴性对照组只加入同体积DMEM培养液，每组设置3个复孔。继续培养48 h，加入Bright-Glo试剂在多功能酶标仪上检测化学发光数值(RLU值)。相对病毒水平(%)=(实验孔发光数值-阴性对照孔发光数值)/(阳性对照孔发光数值-阴性对照孔发光数值)×100%。

1.6.2 MT-2-HIV-1ⅢB细胞模型 取调整浓度为2×105cells/ml的MT-2细胞，加入HIV-1ⅢB病毒液(MOI=0.01)混匀后接种至96孔板，根据组别设置分别加入梯度浓度的芒果叶提取物和AZT，培养72 h后吸取上清液转移至提前1 d接种好TZM-bl细胞的孔板，继续培养24 h，余下操作和步骤同方法1.6.1。

1.7HIV-1诱导细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)的抑制作用观察 取方法1.6.2培养72 h后的96孔板(MT-2细胞+HIV-1ⅢB毒株)，使用全自动细胞成像仪观察不同浓度的芒果叶提取物处理后HIV-1诱导的CPE，并拍照记录。CPE的判断标准[16]：视野内无细胞病变为阴性(-)，有25%细胞病变为弱阳性(+)，50%细胞病变为阳性(++)，75%细胞病变为强阳性(+++)，100%细胞病变为超强阳性(++++)。

2 结果

2.1芒果叶提取物在TZM-bl-HIV-1ⅢB模型中的体外细胞毒性和抗HIV-1活性实验结果 在TZM-bl-HIV-1ⅢB模型中，芒果叶提取物的最大无毒性浓度为54.40 μg/ml，在安全浓度范围内能抑制HIV-1的复制，相对病毒水平随着药物的浓度升高而降低，呈剂量依赖性(见图1)。阳性对照药物AZT在最大实验浓度下对TZM-bl的细胞活性几乎不产生影响，相对病毒水平随AZT的浓度升高呈下降趋势，呈剂量依赖性(见图2)。该模型的CC50和IC50见表1。

图1 芒果叶提取物在TZM-bl-HIV-1ⅢB模型中的体外细胞毒性和抗HIV-1活性实验结果图

图2 AZT在TZM-bl-HIV-1ⅢB模型中的体外细胞毒性和抗HIV-1活性实验结果图

2.2芒果叶提取物在MT-2-HIV-1ⅢB模型中的体外细胞毒性和抗HIV-1活性实验结果 在MT-2-HIV-1ⅢB模型中，芒果叶提取物的最大无毒性浓度为54.40 μg/ml，在安全浓度范围内能抑制HIV-1的复制，相对病毒水平随着药物的浓度升高而降低，呈剂量依赖性(见图3)。阳性对照药物AZT在最大实验浓度下对MT-2的细胞活性几乎不产生影响，相对病毒水平随AZT的浓度升高呈下降趋势，呈剂量依赖性(见图4)。该模型的CC50和IC50见表1。总体来看，芒果叶提取物和AZT在TZM-bl-HIV-1ⅢB模型中的抗病毒效果较在MT-2-HIV-1ⅢB模型中更为显著。

图3 芒果叶提取物在MT-2-HIV-1ⅢB模型中的体外细胞毒性和抗HIV-1活性实验结果图

图4 AZT在MT-2-HIV-1ⅢB模型中的体外细胞毒性和抗HIV-1活性实验结果图

表1 两种细胞-病毒模型中芒果叶提取物和AZT的CC50、IC50和SI

2.3芒果叶提取物抑制HIV-1诱导CPE的情况 在MT-2-HIV-1ⅢB模型中，当芒果叶提取物的浓度为54.40 μg/ml时，可观察到MT-2细胞内仅有极少的合胞体形成(见图5ⓑ)；当浓度为10.88 μg/ml时，能观察到少量的合胞体(见图5ⓒ)。而未加入药物的阳性对照孔可见大量的合胞体(见图5ⓕ)；未加入HIV-1ⅢB和药物的阴性对照孔则无合胞体形成(见图5ⓖ)。见表2，图5。

表2 不同干预组HIV-1诱导的CPE情况

ⓐ芒果叶提取物浓度为272.00 μg/ml，大部分细胞死亡，CPE阴性(-)；ⓑ芒果叶提取物浓度为54.40 μg/ml，CPE弱阳性(+)；ⓒ芒果叶提取物浓度为10.88 μg/ml，CPE阳性(++)；ⓓ芒果叶提取物浓度为0.44 μg/ml，CPE强阳性(+++)；ⓔ芒果叶提取物浓度为0.09 μg/ml，CPE超强阳性(++++)；ⓕ阳性对照孔，CPE超强阳性(++++)；ⓖ阴性对照孔，CPE阴性(-)

3 讨论

3.1联合国艾滋病规划署(United Nations Programme on HIV/AIDS，UNAIDS)报告显示，2021年全球AIDS/HIV新发感染约150万例，死亡约65万例，现存HIV感染者约3 840万例[17]。AIDS仍是威胁全人类生命安全的严重传染性疾病之一，提高患者的HAART治疗效果和生活质量是目前关注的热点问题。我国学者通过对中药材库进行筛选，发现了一些具有抑制HIV活性的药物，包括黄连、金银花、紫草、女贞子、肉桂等[18]。经实验验证，这些提取物在抑制HIV活性或增强HIV/AIDS患者免疫功能方面均能起到一定的作用，如思茅松松塔提取物对HIV-1有很强的活性抑制作用[19]；黄芪提取物可降低HIV-1的感染能力[20]；鸦胆子提取物可通过上调抗HIV天然免疫因子蛋白的表达而发挥抑制HIV的作用[21]。芒果叶作为我国传统的中草药，不仅具有悠久的使用历史，而且具有安全性好、原料易得、价格低等优点[22]。药理研究表明，芒果叶有抗菌、抗肿瘤、抗氧化及抗炎等作用[23]，具有潜在的抗HIV药物开发利用价值。

3.2TZM-bl细胞和MT-2细胞均能稳定表达HIV-1感染的相关受体，包括CD4、CXCR4等。TZM-bl细胞基因组内携带了HIV-1长末端重复序列(long terminal repeat，LTR)启动的荧光素酶和β-半乳糖苷酶的报告基因，在HIV-1感染时，受HIV-1 tat原件调控的荧光素酶报告基因能被激发表达，由此可以反映HIV-1感染和复制水平[24]。MT-2细胞是人类T淋巴细胞白血病病毒Ⅰ型转化的人淋巴瘤细胞，被合胞体诱导型(即SI型)毒株HIV-1ⅢB感染后，细胞之间可发生融合，形成多核巨细胞(合胞体)[25]，能直观地体现病毒诱导的CPE。本研究采用TZM-bl-HIV-1ⅢB和MT-2-HIV-1ⅢB两种细胞-病毒感染模型进行实验，结果显示，芒果叶提取物在TZM-bl和MT-2两种细胞中的CC50分别为320.00 μg/ml、174.13 μg/ml，均高于董宜旋和李静[26]研究的三叶青提取物。在两种细胞-病毒感染模型中，芒果叶提取物的最大无毒性浓度均为54.40 μg/ml，高于莫雨晓等[27]研究的石见穿乙醇提取物和谢磊等[28]研究的补骨脂乙醇提取物，说明芒果叶提取物具有良好的安全剂量范围。芒果叶提取物在两种细胞-病毒感染模型中对HIV-1ⅢB的IC50均处于较低浓度水平，分别为8.86 μg/ml、15.23 μg/ml。虽然SI值受多种因素的影响，但通常情况下，化合物的SI值>10，则可认为药物具有较高的安全性[29]。本研究中，芒果叶提取物在两种模型中的SI值均>10，以在TZM-bl-HIV-1ⅢB模型中的作用更为显著，SI值=36.14，高于高丽娜等[30]研究的野棉花、木藤蓼等6种中草药提取物。在两种细胞模型中芒果叶提取物对抗HIV-1活性存在差异，但均能反映其对HIV的抑制效果，对于差异的产生可能是由于TZM-bl细胞和MT-2细胞本身增殖能力不同而造成的，这在以往的研究[31-32]中也有发现。此外，镜下观察可见芒果叶提取物能有效抑制HIV-1诱导的CPE，且呈剂量依赖性。综上结果提示，芒果叶提取物具有潜在的抗HIV-1应用价值。

3.3有研究显示，芒果叶提取物在体外可抑制T细胞内产生的氧化应激，从而提高T细胞的存活率[33]，同时其主要成分芒果苷也可通过抑制淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞中的氧化应激而发挥免疫保护作用[10]，由此推测其抗HIV-1活性可能与抗氧化及免疫调节作用有关。芒果叶提取物抗HIV-1的机制仍需进一步进行实验验证。

综上所述，芒果叶提取物具有显著抗HIV-1活性，且安全性较好，在AIDS/HIV-1新药研发中具有应用前景，后续可进一步提纯分析，探讨其具体的作用机制，以充分发挥中草药资源的应用价值。