怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因克隆及其功能分析

夏瑾华， 李丹丹， 李 然， 刘贤泥， 刘子捷， 罗 冰， 欧丽佳

(1.上饶师范学院生命科学学院，江西上饶 334001； 2.上饶农业技术创新研究院，江西上饶 334001；3.上饶市药食同源植物资源保护与利用重点实验室，江西上饶 334001； 4.上饶市三叶青保育与利用技术创新中心，江西上饶 334001)

怀玉山三叶青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg cv. Huaiyushan)，属葡萄科崖爬藤属植物，为我国特有珍稀药用植物，也是江西省上饶市玉山县特产和国家地理标志农产品，主要分布在以怀玉山山脉为中心的赣、浙、皖、闽相交的海拔800 m以上的高山山区[1]。南昌大学食品科学与技术国家重点实验室的邓泽元教授、孙永教授及其团队对怀玉山三叶青茎叶抗癌活性成分、块根黄酮类成分及其药理学作用进行研究，发现怀玉山三叶青茎叶抗癌活性成分有牡荆素鼠李糖苷、异牡荆素鼠李糖苷、异牡荆素和牡荆素等，块根黄酮类成分有山奈酚芸香糖苷、芦丁、异槲皮苷、儿茶素、紫云英苷等[2]，这些化学成分不但能减慢癌细胞生长、抑制癌细胞增殖、促进癌细胞凋亡，还可作为癌症预防治疗的功能性食品[3-7]。此外，怀玉山三叶青具有较强的抗炎解热活性[8]。2020年2月7日，上饶市卫健委印发《上饶市新型冠状病毒感染的肺炎中医药防治方案(试行)》，其中怀玉山三叶青为新型冠状病毒感染临床治疗期的推荐处方成分。患者在接受三叶青治疗观察后，发热、咳嗽、乏力等呼吸道症状有明显改善[9]。烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)属帚状病毒科(Vigaviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)病毒，可侵染 36 个科的 400 多种植物，每年给全世界农作物造成的经济损失在1亿美元以上[10]。目前有研究表明，烟草病毒复制蛋白2(tobamovirus multiplication protein 2，TOM2A)可以与来自西红柿烟草花叶病毒(tomato mosaic virus，ToMV)感染原生质体的溶解膜130、180 ku的西红柿花叶病毒复制蛋白(tomato mosaic virus replication proteins)共纯化[11]；TOM2A主要定位于液泡膜上，130、180 ku的西红柿花叶病毒复制蛋白和合成烟草病毒相关RNA的活性与液泡膜部分相关[12]；TOM2A在酵母中可以与烟草病毒复制蛋白1(tobamovirus multiplication protein 1，TOM1)相互作用，TOM2A对于膜上烟草花叶病毒(TMV)-Cg复制复合物的形成和/或维持起重要作用[13]。笔者所在课题组在对怀玉山三叶青2个栽培种的转录组分析中发现了TOM2A的亚型即TOM2A-like[8]。本研究将利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术克隆怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like(tobamovirus multiplication protein 2A-like，TP2A-like)基因，并采用生物信息学方法、烟草转基因技术和实时定量 PCR进行序列、功能和组织表达分析，为揭示怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like的生物学功能提供理论依据，为从分子水平调控怀玉山三叶青烟草花叶病毒增殖提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为怀玉山三叶青2个栽培种怀玉1号和怀玉2号的试管苗。试验时间为2021年4—10月。试验地点为上饶师范学院生命科学学院。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取和cDNA第一链的合成 用Trizol 试剂提取怀玉山三叶青怀玉2号试管苗的总 RNA，提取步骤按说明书进行，使用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的浓度和完整性。以提取获得的 RNA为模版，按照逆转录酶(M-MLV) cDNA第一链合成试剂盒说明书合成 cDNA 第一链。逆转录引物用 Oligo(dT) 18：5′-G G C C A C G C G T C G A C T A G T A C T T T T T T T T T T T T T T T T T T-3′，CDNA合成具体步骤按M-MuLV反转录酶说明书进行。

1.2.2 烟草病毒增殖蛋白2A-like基因的克隆 利用转录组组装的Unigene序列信息(TRINITY_DN36028_c0_g3)，运用 Primer Premier 5.0 设计引物(F：5′-A T G G C G T G C C G A G G T T G C-3′；R：5′-C A T G A T G G T G C A T C G G C T C C-3′)。PCR扩增条件：95 ℃ 预变性 2 min；95 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将含有目的基因的条带与 pMD19-T 载体连接并用热激法转化到感受态细胞大扬杆菌(Escherichiacoli)DH5α，经鉴定正确的阳性转化子提取质粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.2.3 烟草病毒增殖蛋白2A-like基因的生物信息学分析 采用尹明华等的方法[14]对烟草病毒增殖蛋白2A-like基因进行生物信息学分析。

1.2.4 基因克隆和载体构建 以提供的目的基因序列设计引物(去掉终止密码子TAG/TAA/TGA)[CZ-TP2A-like-BamHⅠ-GFPF：5′-A T G T C T A G A C T C G A GA T G G C G T G C C G A G G T T G C-3′；CZ-TP2A-like-BamHⅠ-GFPR：5′-G G C C G C T G T A C A C A TC A T G A T G G T G C A T C G G C T C C-3′(下划线的碱基组成为载体同源重组序列)]进行PCR扩增。PCR反应体系(总体积50 μL)包括17 μL ddH2O、25 μL 2×Phanta Max Buffer、1 μL dNTP Mix(10 mmol/L each)、2 μL模板DNA、2 μL引物1(10 μmol/L)、2 μL引物2(10 μmol/L)和1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymease(1 U/μL)。PCR反应程序：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性15 s，59 ℃ 退火15 s，72 ℃延伸1 min，39个循环；最后72 ℃延伸5 min。将PCR产物进行凝胶电泳。将条带切胶回收，即为目的基因片段。用BamHⅠ酶切载体pCambia2301-KY-GFP线性化，回收后和目的基因片段重组反应。酶切反应体系包括2 μL 10×K /10×L Buffer、5 μL 载体质粒、2 μLBamHⅠ/KpnⅠ和ddH2O(补足至40 μL)。酶切产物纯化后与上述PCR产物进行重组反应。重组连接反应体系(总体积10 μL)包括4 μL 线性化载体、1 μL 插入片段、2 μL 5×CE Ⅱ Buffer、1 μL Exnase Ⅱ和ddH2O(补足至10 μL)。重组产物转化大肠杆菌DH5α细胞。挑取PCR阳性的转化子摇菌培养提取质粒，同时对扩增产物进行测序。扩增和测序引物为插入目的基因两侧的载体序列，分别为35S-F：5′-G A C G C A C A A T C C C A C T A T C C-3′；GFP-JR：5′-G G G T G A G C T T G C C G T A G G T G G-3′。

1.2.5 烟草叶片亚细胞定位 采用尹明华等的方法[14]对烟草病毒增殖蛋白2A-like基因进行烟草叶片亚细胞定位。

1.2.6 烟草病毒增殖蛋白2A-like转基因株系PCR检测 烟草叶片用农杆菌侵染后均经过4次筛选/继代，诱导出抗性芽，再转入伸长培养基中。采用PCR对其再生苗进行鉴定，得到烟草病毒增殖蛋白2A-like基因的烟草转基因株系。引物F： 5′-A T G G C G G C G T G C C G G G G W T-3′；R：5′-C A T T A C G R T G C A A C G G C T C C-3′。2×TaqMaster Mix扩增体系(共20 μL)包括7 μL ddH2O、10 μL 2×TaqMaster Mix、1 μL 模板DNA、1 μL引物1(10 μmol/L)、1 μL引物2 (10 μmol/L)。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火 30 s ，72 ℃延伸 60 sec/kb，35个循环；72 ℃彻底延伸5 min。

1.2.7 烟草病毒增殖蛋白2A-like转基因株系和非转基因株系移栽苗的病毒接种和光合指标检测 采用尹明华等的方法[14]对烟草病毒增殖蛋白2A-like转基因株系和非转基因株系移栽苗的病毒接种和光合指标进行检测。

1.2.8 烟草病毒增殖蛋白2A-like基因的组织表达分析 分别取怀玉山三叶青2个栽培种怀玉1号和怀玉2号试管苗的根、茎、叶RNA各500 ng，反转录为cDNA。荧光定量 PCR(qRT-PCR，SYBR GreenⅠ)检测内参基因为GAPDH。设计引物为R：5′-G C T T T G G G C A G T T T A T C C-3′；F：5′-T T C C A G C G A A A C C C T T A C-3′。qRT-PCR 检测采用 20 μL 反应体系，PCR反应程序： 95 ℃预变性10 min；95 ℃ 变性10 s，52 ℃ 退火34 s， 95 ℃延伸15 s，40个循环。使用 2-ΔΔCT法计算基因表达水平。试验重复3次。所有数据表示为平均值±标准差，并使用SPSS 19.0软件进行统计分析，应用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验烟草病毒增殖蛋白 2A-like基因组织表达的差异显著性(α=0.05)。

2 结果与分析

2.1 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因cDNA序列、氨基酸序列和亲疏水性分析

通过PCR扩增，怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因cDNA总长度为828 bp(图1)，G+C 含量为46.50%(图2)。

ProtParam预测的怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like氨基酸序列见图3。怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like由275个氨基酸组成，分子量为30 728.97 u，等电点为5.39，为疏水性蛋白。

各氨基酸的数量和比例详见表1。带负电残基的氨基酸(Asp+Glu)总数为28个，带正电荷残基(Arg+Lys)总数为26个。序列的N端和C端均为M(Met)。失稳指数(II)计算为47.71，说明该蛋白质为不稳定蛋白质。

表1 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like氨基酸的数量和比例

由图4可知，高峰值(正值)的区域表示疏水的区域，而负值的低谷区域是亲水区域。疏水性分析结果表明，最大疏水值为4.0左右，在该多肽中说明该处的疏水性最强；亲水峰最大值为-2.5左右，整个蛋白质表现出高度的疏水性，说明该蛋白为疏水性蛋白质。

2.2 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like二级结构和三级结构分析

李小树发火了，我第一次见到李小树对大黑猫发那么大的火，他气急败坏地提着大黑猫的后颈窝一把把它扔出了窗外。大黑猫被扔出去后又撕心裂肺地叫着从窗口爬了进来，李小树仍没解气，他从杂屋间找来一个废旧的纸箱，三下两下就把大黑猫装进了纸箱里，然后把它送给了我。

怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like的二级结构(图5)预测如下：GOR预测显示其二级结构由α螺旋(Hh，28.36%)、β-片层(Ee，20.73%)、无规则卷曲(Cc，50.91%)构成。从分布位点上来看，C端和N端含无规则卷曲、β-片层和α-螺旋，且无规则卷曲、β-片层和α-螺旋散布于整个蛋白质中。SWISS-MODEL预测结果显示，怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like的三级结构为单体跨膜蛋白(图6)。

2.3 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like亚细胞定位预测

采用 WoLFPsort在线软件对怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因的表达部位进行预测，结果(图7)表明，定位于液泡膜中的数量为9，质膜中的数量为2，胞外的数量为1，内质网中的数量为1，高尔基体中的数量为1。表明怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因主要存在液泡膜中。

2.4 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like系统进化分析及其同源蛋白的序列比对

从构建的进化树(图8)中可见，怀玉山三叶青与葡萄(Vitisriparia)在一个大分支中，这说明怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like在进化上与葡萄tobamovirus multiplication protein 2A(GenBank： XP_034708140.1、XP_002279170.2)的同源性最高，同源性达到86.79%。

怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like同源蛋白的序列比对信息见图9，*号区域是烟草病毒增殖蛋白家族的保守结构域。

以提供的目的基因序列设计引物(去掉终止密码子TAG/TAA/TGA)进行PCR扩增。将PCR产物进行凝胶电泳。结果显示：在目标位置扩增到单一条带，大小正确。将条带切胶回收，即为目的基因片段(图10)。用BamHⅠ/KpnⅡ酶切载体pCambia2301-KY-GFP线性化，回收后和目的基因片段重组反应。重组产物转化大肠杆菌DH5α细胞。挑取PCR阳性的转化子摇菌培养提取质粒，对重组质粒进行酶切检测，同时对扩增产物进行测序。测序比对结果显示：目的基因已插入载体，表达载体构建准确(图11)。

2.6 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like亚细胞定位分析

通过烟草叶片瞬时表达，将烟草病毒增殖蛋白2A-like融合绿色荧光蛋白(GFP)的载体质粒2301-TP2A-GFP转入农杆菌，吸取农杆菌液，压迫注入烟草叶片下表皮(背面)进行烟草病毒增殖蛋白2A-like亚细胞定位分析(图12)。利用激光共聚焦显微镜观察，融合GFP的烟草病毒增殖蛋白2A-like转化烟草叶片只在细胞质和细胞核观察到绿色荧光，表明烟草病毒增殖蛋白2A-like定位于细胞质和细胞核，与 WoLFPsort在线软件预测结果一致。

2.7 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like转基因烟草鉴定和光合特征

经PCR检测，获得怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like转基因阳性烟草和转基因阴性烟草(图13)。光合生理的测定结果表明：与怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like转基因阴性烟草相比较，怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like转基因阳性烟草的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、最大光化学效率(Fv/Fm)、实际光化学量子效率(ΦPSⅡ)、光化学淬灭系数(qP)及电子传递效率(ETR)显著下降，而非光化学淬灭系数(NPQ)显著上升(表2)。

表2 怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like转基因阳性植株和转基因阴性植株的光合参数和叶绿素荧光参数比较

2.8 怀玉山三叶青2个栽培种不同器官中烟草病毒增殖蛋白2A-like基因的表达分析

以怀玉山三叶青的GAPDH为内参基因，利用实时荧光定量PCR分析怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因在怀玉山三叶青2个栽培种不同器官中的表达情况，结果显示，怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因在怀玉2号和怀玉1号2个栽培种的根、茎、叶中均有表达，其中在根和茎中的表达差异不显著，而在叶中的表达量显著增高(图14)。

3 讨论与结论

Hagiwara等的研究表明，TOM2A主要定位于液泡膜上，花叶病毒复制蛋白和合成烟草病毒相关RNA的活性与液泡膜部分相关[12]。在本试验中，怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因cDNA总长度为828 bp，G+C含量为46.50%；怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like由275个氨基酸组成，分子量为30 728.97 u，等电点为5.39，为疏水性蛋白；二级结构由α-螺旋(28.36%)、β-片层(20.73%)、无规则卷曲(50.91%) 构成；三级结构为单体跨膜蛋白；软件预测怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like亚细胞定位于液泡膜，但通过烟草叶片亚细胞定位分析发现，烟草病毒增殖蛋白2A-like定位于细胞质和细胞核中。说明烟草病毒增殖蛋白2A-like与TOM2A的亚细胞定位不同。从碱基组成和G+C含量基本平衡来看，G+C的含量越高，基因稳定性越高，三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因基本处于稳定状态，这可能为三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因稳定遗传与进化提供了保证。怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白 2A-like 与葡萄烟草病毒增殖蛋白2A(GenBank：XP_034708140.1、XP_002279170.2)的同源性最高，同源性达到86.79%，说明三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因具有保守性。这些保守区段的发现将为其他物种新的三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因的克隆提供序列依据。还有研究表明，拟南芥TOM1和TOM2A是烟草病毒细胞内高效增殖所必需的完整膜蛋白[12]。

怀玉山三叶青繁殖主要靠无性繁殖，由于这一繁殖特点，受到病毒侵染后，会世代传染[1]。怀玉山三叶青一旦感染烟草花叶病毒后，会导致种性退化，产量下降，品质变劣[1]。有研究表明，枸杞感染病毒后叶绿素含量显著下降，光合强度显著降低[15]；甘薯感染甘薯羽状斑驳病毒和甘薯潜隐病毒后，蔓长短，分枝少，叶片数不多，SPAD 值低，光合效应下降[16]。在本试验中，与怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like转基因阴性烟草相比较，怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like转基因阳性烟草的光合参数(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、最大光化学效率(Fv/Fm)、实际光化学量子效率(ΦPSⅡ)、光化学淬灭系数(qP)及电子传递效率(ETR)显著下降，而非光化学淬灭系数(NPQ)显著上升，表明怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因通过烟草花叶病毒增殖继而影响烟草的光合作用。这与上述他人的研究结果一致。

研究表明，基因的组织表达特征与其功能紧密相关[16-17]。在本试验中，实时定量PCR结果显示，怀玉山三叶青怀玉2号和怀玉1号烟草病毒增殖蛋白2A-like基因均在叶中表达量最高，表明怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因在叶片的烟草病毒增殖过程中起着重要的调控作用。