肩关节轴向拔伸法对兔肩周炎模型炎症因子表达的影响*

周 进，范 芸，段必双，李盈盈，李英菁，涂添添，喻 俊

(1.云南中医药大学第一附属医院，云南 昆明 650021；2.云南中医药大学针灸推拿康复学院，云南 昆明 650504)

肩周炎是临床常见病多发病，好发于50岁左右的女性，主要病因为劳损、受风寒湿邪侵袭、制动等导致肩关节周围的肌肉、韧带、滑膜等软组织出现慢性炎症，进而局部软组织黏连，临床多表现为肩部疼痛，夜间痛甚，肩部活动功能渐进性受限。肩周炎在治疗时因为局部组织黏连会导致疗程长、效果差，手法剥离黏连时，患者疼痛加剧，难以忍受，心理负担较重，这些问题都是肩周炎治疗过程中面临的困难[1]。通过临床观察，肩关节轴向拔伸法对黏连期肩周炎有明显疗效，它可以减轻局部疼痛，松解局部黏连，使肩部活动功能得以改善[2]，该手法临床效果明显，但一直缺乏基础实验研究。本实验通过肩关节轴向拔伸法干预兔肩周炎模型耳缘静脉血清TNF-α、IL-6及患肩滑膜及肌肉组织中PGE-2、TGF-β1的表达，探讨肩关节轴向拔伸法治疗肩周炎的疗效机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与动物分组 选体重在1.6～2.3 kg成年实验家兔，共40只，由昆明市实验动物中心(艾尼莫公司)提供，由云南中医药大学动物室喂养，室温18℃～24℃，湿度35%～55%，实验环境保持干净卫生。先进行适应性喂养，1周以后随机分成4组，每组10只：空白组、模型组、对照组及实验组。整个实验过程均按照科技部〔2006〕398号文件执行[3]，严格实施，以动物伦理学规定善待动物，对其处置均符合要求。

1.2 主要仪器设备 厂家及名称：安徽中科中佳公司提供低温高速离心机，型号：SC-3610；中科美菱公司提供低温冰箱(-80℃)；美国eppendorf公司提供微量加样器(10μl)、多通道移液器(300ul)；美国伯乐公司提供全自动酶标仪，型号：Model 550；美国Millipore公司提供Milli-Q纯水器；常熟市学科电器有限公司提供制冰机；北京优晟联合科技有限公司提供旋涡混合器；江苏太仓市实验设备厂提供ZD-9556水平摇床。

1.3 主要试剂 厂家及名称：北京晶美生物工程公司提供TNF-α、IL-6酶免试剂盒；北京绿源伯德生物公司提供PGE-2酶免试剂盒；武汉赛培生物公司提供TGF-β1酶免试剂盒；昆明制药厂提供碘伏消毒剂、75%乙醇、0.9%氯化钠注射液；北京化学试剂厂提供水合氯醛。

1.4 模型兔制作 采用模拟风寒湿邪环境加持续劳损法[4]制作兔肩周炎模型。以家兔右肩峰端为中心，在直径约7 cm的面积用Na2S脱毛。先将家兔仰卧在操作台上，然后固定左前肢和双后肢，松紧适度，右前肢远端和电动振荡器固定，使肩关节摇动，其余关节可以固定，尽量不要摇动，270次/min的频率，1.5 cm的振幅，连续3 d，每天至少8 h不间断。专人固定查看摇动情况，注意右前肢不要松动和脱落。然后将家兔右前肢固定在兔笼上，用冷冻后的小号蓝冰袋外敷家兔右肩部，及时更换融化后的蓝冰袋，连续3 d，每天至少外敷8 h。调电吹风为冷风模式，在摇动和冰敷期间，持续吹家兔右肩。3 d后观察家兔情况，发现其右前肢外翻，活动功能受限，爬行朝右侧偏斜，表明家兔右肩有疼痛反应。通过肉眼观察家兔右肩软组织肿胀，局部有充血或瘀斑，提示造模成功[5]。造模后正常喂养3 d开始实验干预。

1.5 干预方法 空白组常规饲养，不造模不予手法治疗；模型组常规饲养，造模但不予手法治疗；对照组采用推拿常规手法治疗，每日上午10∶00～12∶00时由推拿专业研究生专人固定操作，每次干预时间为20 min；实验组予肩关节轴向拔伸手法，也是每日上午10～12时由推拿专业研究生专人固定操作，每次干预时间为20 min；对照组和模型组均连续手法治疗20 d。

1.5.1 常规推拿手法[6]将模型兔仰卧在操作台上，左前肢及双后肢固定，用按揉法及弹拨法在右前肢肩部施术，松解肩部紧张的肌肉、肌腱等软组织，以及肩胛骨周围；再弹拨肩前后紧张的肌筋膜，共8 min。接着，点压肩周穴位，如肩井、肩髃、肩贞等，在黏连处施弹拨法，共5 min。然后，一手扶住家兔右前肢肩部，另一手扶肘部，由小到大的幅度环转摇动肩部，共5 min。最后再内收、外展、后伸右前肢，内外旋转肩关节，共2 min，结束治疗。

1.5.2 肩关节轴向拔伸手法 将模型兔仰卧在操作台上，左前肢及双后肢固定，用按揉法及弹拨法在右前肢肩部施术，松解肩部紧张的肌肉、肌腱等软组织，以及肩胛骨周围；再弹拨肩前后紧张的肌筋膜，共5 min。接着，点压肩周穴位，如肩井、肩髃、肩贞等，在黏连处施弹拨法，共4 min。充分放松肩部软组织，再用肩关节轴向拔伸法治疗，步骤为：(1)外展患肢，外展状态下进行拔伸，持续用力，力量由轻到重，再由重到轻，在拔伸的同时进行内外旋转肩关节。(2)上举患肢，上举状态下进行拔伸，持续用力，轻重交替，在拔伸同时进行内外旋转肩关节。(3)后伸患肢，后伸状态下进行拔伸，持续用力，内外旋转肩关节。上述手法反复施术，直到黏连之患肩有所松动，共10 min。最后，在患肩周围按揉，手法轻柔渗透，来回搓动患侧肩部及上肢，共1 min，结束治疗。

1.6 标本采集 所有动物于实验结束后1 d取材。首先在各组模型兔的耳缘静脉取血各5 mL，以备检测血清TNF-α、IL-6的含量；然后以10%水合氯醛、2 mL/kg体重比例，注射入耳缘静脉，待麻醉完全后快速取材，在肱二头肌、冈上肌、冈下肌、滑膜囊等部位取大小相同的组织块放置在平整的冰面上，用0.9NS%漂洗表面血水，干净后放入离心管，送至实验室以-5℃低温保存待测。最后以注射空气法，在耳缘静脉注入10 mL左右空气，处死家兔。在实验过程中因肠道感染死亡8只兔，分别为空白组1只、模型组2只，对照组2只，实验组3只。

1.7 指标检测 备好无抗凝剂的真空采血管，将各组抽取的耳缘静脉血(5 mL)置于采血管中，室温下自然凝固约15 min，在4℃条件下以每分钟3000转离心20 min，再分离血清，取上清液，贮存在零下70℃冰箱里待测。备好匀浆介质(成分：ph7.4、0.01 mol/L Tris-HC1、0.0001 mol/L EDTA 0.01 mol/L蔗糖、PMSF 0.1 mmol/L、BSA 0.1%)，将取好的组织块放入冰水中，按10%比例放入匀浆介质，用手术剪剪碎组织块，超声匀浆30 s，在4℃条件下以每分钟3000转离心20 min，取上清液，存放在零下70℃冰箱中待测。采用酶联免疫吸附法(ELISA)，严格按试剂盒操作步骤检测TNF-α、IL-6、PGE-2、TGF-β1。

2 结果

2.1 4组局部组织肉眼观察结果 空白组从外观上观察，局部形态正常，皮肤颜色透亮，肌腱组织收缩有弹性；肌肉组织饱满、收缩有韧性、颜色红润；滑膜组织薄亮，收缩有紧致感。模型组肩部形态肿胀，可见肌腱组织充血肿胀，弹性差；肌肉组织色深红或瘀斑，收缩韧性差，关节腔中有少量淡黄色液体渗出；滑膜组织稍厚，颜色较暗，收缩乏力。对照组的肌腱组织颜色白亮，收缩时柔韧性稍好；肌肉组织色暗，光泽度较差，关节腔中有少量微黄色液体渗出；滑膜组织较薄。实验组肩部肌腱组织光亮，柔韧性好；肌肉组织色鲜红，收缩弹性好，关节腔滑液颜色清澈；滑膜组织外观薄亮，收缩有紧致感。

2.2 4组实验兔肩关节肿胀程度比较 4组兔干预前后肩关节周长变化为：对造模后的三组家兔肩关节周长进行测量，发现均显著增大(P<0.01)；干预后，测量对照组及实验组肩关节周长，发现均显著减小(P<0.01)；测量干预后实验组肩关节周长，发现较对照组显著减小(P<0.01)，见表1。

表1 各组兔干预前后肩关节周长比较

2.3 4组实验兔血清TNF-α、IL-6水平比较 模型组与空白组比较，血清TNF-α、IL-6表达均显著增加(P<0.01)；对照组与模型组比较，血清TNF-α、IL-6表达均显著降低(P<0.05)；实验组与模型组比较，血清TNF-α、IL-6表达均显著降低(P<0.01)；实验组与对照组比较，血清TNF-α、IL-6表达均显著降低(P<0.05)。详见表2。

表2 各组兔血清TNF-α、IL-6水平变化比较

2.4 4组兔肱二头肌、冈上肌、冈下肌、滑膜囊中PGE-2含量比较 空白组实验兔肱二头肌、冈上肌、冈下肌、滑膜囊中PGE-2有少量表达，模型组中PCE-2含量较空白组显著升高(P<0.01)；对照组中PCE-2含量较模型组下降明显(P<0.05)；实验组中PCE-2含量较模型组显著下降(P<0.01)；实验组中PCE-2含量较对照组显著下降(P<0.05)。详见表3。

表3 各组兔肱二头肌、冈上肌、冈下肌、滑膜囊中PGE-2含量变化比较

2.5 四组兔肱二头肌、冈上肌、冈下肌、滑膜囊中TGF-β1含量比较 空白组实验兔肱二头肌、冈上肌、冈下肌、滑膜囊中TGF-β1有少量表达，模型组中TGF-β1含量较空白组显著升高(P<0.01)；对照组中肱二头肌、冈上肌、滑膜囊中TGF-β1含量较模型组下降明显(P<0.01)；实验组中TGF-β1含量较模型组显著下降，具有显著统计学意义(P<0.01)；实验组肱二头肌、冈下肌中TGF-β1含量较对照组显著下降(P<0.01)。详见表4。

表4 各组兔肱二头肌、冈上肌、冈下肌、滑膜囊中TGF-β1含量变化比较

3 讨论

迄今为止，许多学者对肩周炎进行了大量研究，但其病因病理仍不清楚，因此有很多病因病理学说存在。有研究发现，肩周炎的发生和许多因素都有相关性，如糖代谢异常、甲状腺疾病、器质性心脏病等[7]。糖尿病的病理过程可以导致继发性肩周炎[8]，病理改变主要是引起细小血管硬化、内分泌失调等，从而导致肌肉肌腱等软组织病变，这些病理变化可以加重肩关节纤维化，引起许多炎症因子释放，进一步导致肩部关节滑膜和韧带复合体的炎性反应和纤维变性[9-10]。王正和等[11]临床研究表明，患者不断受到风寒侵袭，肩部的血液循环受阻和代谢异常，肩关节及其周围会出现无菌性炎性反应和黏连，最终导致肩部疼痛、活动受限。王绪辉[12]通过动物实验，观察到模型兔肩部细小血管充血，炎症反应强烈，包括局部组织缺血、炎细胞浸润、变性等病理变化，这都和人类肩周炎病理过程类似。

近年来许多学者对肩周炎的发病机制进行了临床及基础研究。褚立希等[13]发现肩周炎患者肩部毛细血管扩张，炎性反应较重，组织液渗出导致水肿和坏死，影响了局部代谢，引起痛性物质释放导致疼痛。Neviaser[14]通过手术活检患者的挛缩关节囊，发现关节囊炎变。

Deplma通过手术发现患者肩部也有炎症反应，这和关节周围肌腱不断滑动有关。Ogilvie[15]在关节镜检查中观察到患者肩部关节囊周围有纤维化和滑膜炎。Omari[16]认为，肩周炎的产生主要是滑膜炎以及各种炎性细胞、胶原及纤维细胞异常增殖，导致关节囊挛缩。Bunker等[17]对手术采集的标本进行组织学和免疫学研究发现，肩周炎的本质是纤维增生。

根据国内外学者的大量研究，认为炎症反应和局部组织纤维化是肩周炎的病理基础。一些学者的研究结果表明，肩周炎局部炎症反应和修复过程都是大量炎性细胞因子参与的结果[18]。炎性细胞因子主要包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和前列腺素E-2(PGE-2)。TNF-α是一种多肽细胞因子，它是由单核-巨噬细胞产生的。作为重要介质参与多种生理反应和免疫反应，和一些细胞因子维持内环境稳定，也介导感染、创伤等病理过程。商得俊[19]发现，TNF-α在肩周炎患者的血清中明显升高，从而释放出大量的炎症介质，同时诱导其他细胞因子(如IL-1、IL-6，IL-8)产生，加重炎症反应，参与疼痛的发生、发展和结局。IL-6是多效细胞因子之一，可把炎症细胞聚集在一起，激活和释放炎症介质，不断加速炎症过程。PCE-2是一种由巨噬细胞合成和释放的重要炎性致痛物质，它可参与一系列炎症和免疫病理生理过程。我们已知过度劳损会导致肩周炎。在劳损应变过程中，肩部组织的氧化代谢增强，细胞膜通透性增加，线粒体膨胀，溶酶体释放大量炎症性致痛物质，如PGE-2、5-羟色胺、缓激肽等，引起肩部周围软组织的无菌性炎症和疼痛[20]。肩周炎局部组织纤维化的过程主要与转化生长因子β1(TGF-β1)有关。TGF-β1是一种有巨大生物学活性的，促进伤口愈合的细胞因子，它在纤维化和瘢痕形成过程中起到关键作用[21-22]。Rodeo SA等[23]研究显示，原发性肩周炎和继发性肩周炎患者肩关节囊中TGF-β1及其受体的表达明显升高。李宏云等[24]也发现肩周炎患者肩袖间隙组织中TGF-β mRNA的表达水平明显升高，这说明TGF-β1对肩周炎的发生发展中起重要作用。因此，肩周炎的病理过程离不开炎症因子和炎症引起的纤维化，这种无菌性炎症会导致疼痛和组织黏连，从而导致肩关节功能障碍[25]。

肩关节轴向拔伸法遵循肩关节解剖结构学原理，对于不同的黏连病理采用相应的体位和松解步骤，具有明确的解剖学基础，轴向手法松解力可直达病灶局部，通过对病灶的松解剥离，解除病灶局部组织的黏连，起到“松、动、通”的作用，从而缓解疼痛，达到恢复肌肉组织正常解剖学结构和功能的目的。通过和传统推拿手法治疗对比，肩关节轴向拔伸法治疗肩部病变的软组织更为直接和具有针对性，其粘连组织得到有效松解，炎症得到消除，肿胀明显减小，从而恢复肩关节局部正常组织形态。

本实验结果显示，造模后兔肩周炎模型TNF-α、IL-6、PGE-2、TGF-β1表达明显升高，说明局部炎症反应强烈，符合肩周炎病理过程。肩关节轴向拔伸法可显著改善肩周炎模型兔滑膜及肌肉组织病理学改变，降低PGE-2、TGF-β1表达水平，也可以下调血清TNF-α、IL-6表达水平，因此可以推测，肩关节轴向拔伸法的作用机制为改善肩周炎病变局部组织病理变化，促进组织修复，减少肩关节滑膜及肌肉组织中炎症因子PGE-2、TGF-β1的释放，减轻肩周炎局部组织炎症反应；还可以调节全身免疫，降低血清TNF-α、IL-6水平，通过整体和局部抗炎镇痛对肩周炎起到治疗作用。而且降低炎症因子方面优于传统推拿手法，差异具有统计学意义。综上，肩关节轴向拔伸法能有效改善肩周炎导致的全身和局部症状，而且可以抑制炎症因子的表达和改善局部病理组织形态。