小儿柴桂退热口服液对脂多糖致肺损伤模型小鼠的作用及机制*

杨 亮 ，王 超 ，章子臻 ，张 彦 ，陶 瑞 ，耿嘉浩 ，董 艳 ，王紫翰 ，胡慧子 ，储兆亿 ，马增春 ，洪 倩

（1. 徐州医科大学附属淮海医院·中国人民解放军陆军第七十一集团军医院，江苏 徐州 221004； 2. 合肥师范学院化学与化学工程学院，安徽 合肥 230601； 3. 吉林敖东医药有限责任公司，吉林 延吉 133700； 4. 军事科学院军事医学研究院，北京 100850）

小儿柴桂退热口服液主要成分为柴胡、桂枝、黄芩，具有发汗解表、清里退热功效，对三联菌致发热模型家兔和酵母菌致发热模型大鼠均有明显的解热作用，对小鼠耳肿胀、大鼠足肿胀和毛细血管通透性等有抑制作用，抗炎作用显著［1］。此外，还具有显著的抗病毒作用，能明显降低小鼠热痛反应和醋酸致小鼠抱体反应次数，提高小鼠单核巨噬细胞系统的吞噬功能及血清溶血素水平，可用于镇痛和增强机体免疫功能［2］。中药复方对新型冠状病毒肺炎（COVID-19）患者的康复有重要作用［3］。脂多糖（LPS）诱导的小鼠肺组织感染模型与临床病毒感染相似，是模拟新型冠状病毒感染的理想替代动物模型［4-5］。核转录因子 - κB（NF- κB）蛋白最早是由David Baltimore 发现，该蛋白家族可选择性地结合在B 细胞κ - 轻链增强子上调控许多基因的表达。几乎所有动物细胞中都能发现NF - κB，其参与细胞对外界刺激的响应，如细胞因子、辐射、病毒等。免疫细胞通过Toll 样受体（TLR）、视黄酸诱导基因蛋白I（RIG - I）样受体（RLR）、核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体（NLR）等模式识别受体（PRR）对机体内环境的变化进行免疫监视，实现固有免疫系统功能。NLR 家族是位于胞质内的一类PRR，可识别病原相关分子模式或损伤相关分子模式，与衔接蛋白结合形成致密的蛋白复合体，即炎性小体，诱导半胱氨酸活化酶1（Caspase-1）剪切活化［6］，活化的 Caspase-1可促进炎性因子白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素18（IL-18）加工、成熟和分泌，并介导细胞焦亡。活化的NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎性小体在各种病原体感染、肿瘤等多种疾病的发生、发展过程中起重要作用［7］。因此，本研究中探讨了小儿柴桂口服液对LPS诱导肺损伤模型小鼠的作用及机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：NIKON E80i型显微镜（尼康仪器<上海>有限公司）；HF90 型37 ℃恒温箱（上海力申科学仪器有限公司）；FC5515R 型微量高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）；85-2型数显恒温磁力搅拌器（常州普天仪器制造有限公司）；EPS 300 型电泳仪（北京中西华大科技有限公司）；DS-H200 型水平摇床（武汉塞维尔生物科技有限公司）；DW - 86L626 型医用低温冰箱、BCD - 248W 型普通冰箱（青岛海尔生物医疗股份有限公司）；IMS - 20 型制冰机（上海燕丰厨业有限公司）；GDSFJ 型酶标仪（三丰精密量仪有限公司）；5200 Multi 型化学发光成像仪（上海天能科技有限公司）；BC-2800 vet 型迈瑞兽用全自动血液细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）。

试药：LPS（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号为J2111625）；小儿柴桂退热口服液（吉林敖东药业集团股份有限公司，批号为2107005）；连花清瘟胶囊（石家庄以岭药业有限股份公司，批号为A2111057）；苏木素-伊红染液（HE，上海碧云天生物技术有限公司，批号为081120201016）；肿瘤坏死因子 - α（TNF- α）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（批号为DG30048M -96），IL-1β ELISA试剂盒（批号为DG30045M-96），均购自北京东歌博业生物科技有限公司；超敏增强型化学发光（ECL）试剂盒（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号为CR2120085）；甘油醛 - 3- 磷酸脱氢酶（GAPDH，批号为 301341）；NF - κB（批号为 ab32536），NLRP3（批号为ab263899），IL - 1β（批号为ab254360），均购自艾博抗上海贸易有限公司。

动物：60只雄性KM 小鼠，体质量（20 ± 2）g，购于安徽省实验动物中心，实验动物生产许可证号为SYXK（皖）2020 - 001，饲养于12 h/ 12 h 明暗交替、温度23～25 ℃的环境中。动物实验经合肥师范学院实验动物伦理委员会审批，实验设计符合动物伦理要求，实验操作人员经过动物实验考核合格。

1.2 方法

分组、建模与给药：按随机数字表法将60只小鼠分为空白对照组（A组），模型对照组（B组），小儿柴桂口服液低、中、高剂量组（C1组、C2组、C3组），阳性对照组（D 组），各10 只。除A 组外，其余各组小鼠均一次性尾静脉注射LPS 5 mg/kg，以建立肺损伤模型。D组小鼠灌胃溶于生理盐水的连花清瘟胶囊5 mg/kg，C1组、C2组、C3组小鼠分别灌胃8，16，32 mg/ kg 小儿柴桂口服液，A组和B组小鼠灌胃等量生理盐水，均连续给药3 d。

肺组织干/湿质量比测定：取肺组织适量，称定质量，即为湿重；60 ℃烘干72 h，称定质量，即为干重。干/湿质量比（%）=干重/湿重×100%。

血液常规分析：采用BC-2800vet 型迈瑞兽用全自动血液细胞分析仪检测各组小鼠的血常规，包括白细胞计数（WBC）、中性粒细胞计数（NEUT）、红细胞比容（HCT）、血小板计数（PLT）、血红蛋白（Hb）、红细胞分布宽度变异系数（RDW-CV）、红细胞分布宽度的标准差（RDW -SD）、淋巴细胞（LYMPH）、单核细胞（MONO）、嗜碱性粒细胞（BASO）。

小鼠肺组织病理变化观察：每组随机选取3 只小鼠，取肺组织，用4%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋并制作厚度为1 mm 的切片，用HE 染色，显微镜下观察肺组织的病理变化。

炎性因子水平测定：按ELISA试剂盒说明书测定各组小鼠血浆中炎性因子TNF-α和IL-1β的水平。

免疫印迹（Western blot）法检测小鼠肺相关蛋白表达水平：每组随机选取3 只小鼠，取肺组织，提取总蛋白，BCA 法检测总蛋白含量。进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE），300 mA 转膜1 h，5%脱脂牛奶封闭1 h，加入GAPDH（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、NF- κB（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000）一抗，4 ℃下孵育过夜，TBST 洗涤 3 次，每次 5 min，加入二抗（1∶5 000），室温孵育1 h，最后加入ECL 超敏发光液，曝光，使用Image J软件统计灰度值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 肺干/湿质量比

与A 组比较，B 组小鼠肺组织干/湿质量比显著降低（P<0.01）；与B组比较，C2组、C3组、D组小鼠肺组织干/湿质量比均显著升高（P<0.01）。详见图1。

图1 小儿柴桂退热口服液对脂多糖致肺损伤模型小鼠肺干/湿质量比的影响Fig.1 Effect of Xiaoer Chaigui Antipyretic Oral Liquid on the dry/wet weight ratio of lung tissue of LPS-induced lung injury model mice

2.2 肺组织形态及病理变化

B 组小鼠肺组织水肿程度明显，表面有斑点形成，出现渗出、水肿或炎性浸润；D 组小鼠肠道组织炎性浸润损伤程度显著降低；与B 组比较，C1组、C2组、C3组小鼠肠道组织炎性症状均有减轻，表明小儿柴桂退热口服液能抑制LPS 诱导的肺损伤模型小鼠肺组织的急性损伤。详见图2。

图2 小儿柴桂退热口服液对脂多糖致肺损伤模型小鼠肺组织形态学的影响（n = 3）Fig.2 Effect of Xiaoer Chaigui Antipyretic Oral Liquid on the morphological changes of lung tissue of LPS-induced lung injury model mice（n=3）

2.3 血液生化指标

与 A 组比较，B 组小鼠外周血 WBC，PLT，LYMPH水平均显著降低，HCT 和NEUT 比例（NEUT%）水平均显著升高（P<0.05）；与B 组比较，C2组、C3组小鼠外周血WBC，PLT，LYMPH 水平均显著升高，HCT 和NEUT%均显著降低（P<0.05），表明小儿柴桂退热口服液能显著增加LPS 诱导肺损伤模型小鼠的WBC，PLT，LYMPH数量，且呈量效正相关；C2组、C3组的作用强度均优于D组。详见表1。

表1 小儿柴桂退热口服液对脂多糖致肺损伤模型小鼠血浆中血液生化指标的影响（）Tab.1 Effect of Xiaoer Chaigui Antipyretic Oral Liquid on the blood biochemical indexes in plasma of LPS - induced lung injury model mice（）

表1 小儿柴桂退热口服液对脂多糖致肺损伤模型小鼠血浆中血液生化指标的影响（）Tab.1 Effect of Xiaoer Chaigui Antipyretic Oral Liquid on the blood biochemical indexes in plasma of LPS - induced lung injury model mice（）

指标WBC（× 109/L）NEUT%MONO%BASO%NEUT（× 109/L）LYMPH（× 109/L）MONO（× 109/L）BASO（× 109/L）Hb（g/L）HCT（%）RDW-CV（%）RDW-SD（fL）PLT（× 109/L）A组4.41±1.19 5.47±3.87 3.88±7.14 8.52±3.13 0.22±0.18 3.53±1.14 0.19±0.39 0.37±0.17 179.75±35.07 50.75±8.99 23.13±2.70 30.43±2.04 209.38±98.24 B组1.16±0.82*20.21±13.33*6.11±3.59*11.20±7.06*0.28±0.39 0.71±0.45*0.06±0.03*0.11±0.07*191.75±10.33 71.98±49.39*24.98±1.99 30.71±11.37 124.75±23.81*C1组C2组C3组2.17±0.91 28.26±13.81 6.31±3.18 10.31±7.64 0.52±0.26 1.03±0.42#0.11±0.06 0.21±0.16 138.63±14.77 40.81±3.84#19.61±2.13 29.83±2.27 187.25±46.40#2.74±1.2#18.22±5.62#4.33±3.7#11.84±7.98 0.41±0.14 1.47±0.32#0.10±0.09 0.33±0.28#137.25±10.42 40.65±3.07#19.46±1.81 28.84±2.91 205.63±96.98#2.28±0.81#15.64±11.01#3.39±1.99#13.41±9.54 0.36±0.26 1.38±0.49#0.07±0.05 0.26±0.2 136.50±5.88 40.38±1.77#19.85±0.97 29.56±2.44 208.50±65.61#D组1.54±0.85#13.32±2.68#2.69±0.81#11.48±2.23 0.31±0.06 0.93±0.52#0.06±0.01 0.23±0.04 71.19±75.41 21.07±22.29 10.41±10.90 16.00±15.66 137.05±82.50

2.4 血浆中炎性因子水平

与 A 组比较，B 组小鼠血浆中炎性因子 IL - 1β 和TNF- α 表达水平均显著升高（P<0.01）；与B 组比较，C1组、C2组、C3组小鼠血浆中IL-1β 和TNF- α 表达水平均显著降低（P<0.05），表明小儿柴桂退热口服液能显著增加LPS诱导的肺损伤模型小鼠的炎性变化，且呈量效正相关；C2组的作用强度与D 组相当，C3组的作用强度优于D组。详见图3。

图3 小儿柴桂退热口服液对脂多糖致肺损伤模型小鼠血浆中炎性因子水平的影响Fig.3 Effect of Xiaoer Chaigui Antipyretic Oral Liquid on the inflammatory factor levels in plasma of LPS-induced lung injury model mice

2.5 肺组织中NF-κB/NLRP3 通路蛋白表达水平

与 A 组比较，B 组小鼠肺组织中 NLRP3，NF - κB，IL-1β 蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）；与B 组比较，C2组、C3组、D 组小鼠肺组织中 NLRP3 蛋白表达水平均显著降低（P< 0.05），C1组、C2组、C3组、D 组小鼠肺组织中NF-κB 和IL-1β 蛋白表达水平均显著降低（P< 0.05），表明小儿柴桂退热口服液可能通过抑制NF- κB 和 IL-1β 蛋白介导的 NLRP3 蛋白活化通路而改善LPS诱导的肺损伤模型小鼠的肺部损伤。详见图4。

图4 小儿柴桂退热口服液对脂多糖致肺损伤模型小鼠肺组织中NF-κB/NLRP3通路蛋白表达水平的影响Fig.4 Effect of Xiaoer Chaigui Antipyretic Oral Liquid on the expression level of NF-κB/NLRP3 pathway protein in lung tissue of LPS-induced lung injury model mice

3 讨论

小儿柴桂退热口服液是临床常用中药制剂，具有发汗解表、清里退热作用。方中，柴胡、葛根药性辛凉，可升阳解肌、退热透疹；桂枝、白芍解肌发热，益阴敛营，调和营卫；黄芩清邪郁所化之热；蝉蜕、浮萍退肺热，清里退热。诸药合用，共奏清热利湿、解毒透疹功效［8］。LPS 诱导的急性肺损伤动物模型可最大限度地表征COVID - 19 感染引起的肺损伤，诱导的氧化应激反应与其浓度呈剂量依赖效应［9］。在较低浓度下，LPS 浓度升高会促进机体抗氧化能力上升，但细胞内的抗氧化防御体系仍不能阻止LPS对蛋白质的氧化损伤。参考文献［10 - 13］，本研究中以小鼠尾静脉注射5 mg/ kg LPS 建立肺炎模型，组内差异小。本研究结果显示，与A 组比较，B 组小鼠肺组织干/湿质量比和WBC 均显著降低；与B 组比较，C2组和C3组小鼠肺组织病理损伤改善显著提高。可能与柴胡具有抑菌杀菌、抗病毒作用，葛根具有增强人体免疫力等作用［14］，黄芩具有广泛的抗菌作用有关。

NF-κB 在细胞的炎症、免疫应答等过程中均起关键性作用，若错误调节会引发自身免疫性疾病、慢性炎症及癌症，同时与突触的可塑性、记忆有关［15］。NF-κB家族蛋白包括同源性或异源性二聚体转录因子，能与免疫球蛋白κ 轻链基因增强子B 位点特异性结合，广泛存在于各种细胞中，在细胞受到病毒或细菌感染、氧自由基、DNA 损伤、细胞因子、LPS、紫外线照射等因素刺激后可被活化，通过参与一系列免疫反应、炎性反应，调控细胞及凋亡的基因转录（如细胞因子、生长因子、趋化因子、黏附分子、免疫受体基因），影响体内的细胞分化、炎性反应、免疫反应、肿瘤生长、细胞凋亡等［16］。作为炎症的中央调节因子，NF - κB 控制趋化因子、细胞因子、促炎黏附分子和促炎转录因子的基因转录，激活的NF-κB 可转移到细胞核，并与促炎基因的启动子结合，导致基因表达增强和炎性反应扩增，最终导致组织炎性损伤［17］。因此，阻断NF- κB 转录活性可能是治疗炎性疾病的重要靶点。研究表明，NF - κB 活化水平的免疫调节、NF- κB 降解抑制剂、TNF- α 的抑制可能会导致细胞因子风暴减少，并减轻COVID- 19 的严重程度，故抑制NF - κB 通路在缓解 COVID - 19 的严重程度方面具有潜在作用［18］。

NLR家族是一类位于胞质内的PRR，可与衔接蛋白和 Caspase - 1 结合形成炎性小体，如 NLRP1，NLRP3，NLRP7等。其中，NLRP3炎性小体活化需2个信号。信号1通过配体活化TLR，通过激活NF-κB 等方式介导胞内NLRP3 和 IL-1β 前体表达上调；信号2 通过病原相关分子模式或损伤相关分子模式刺激经信号1 刺激过的细胞，活化NLRP3。而活化的NLRP3炎性小体在各种病原体感染、肿瘤等多种疾病的发生、发展过程中起重要作用［19］。本研究结果显示，B 组小鼠体内 NF - κB 和NLRP-3 蛋白水平均较 A 组显著升高，C2组、C3组小鼠体内的 NF- κB 和 NLRP- 3 蛋白水平均较 B 组显著降低（P< 0.05）。此外，为全面考察小儿柴桂退热口服液对LPS诱导肺损伤模型小鼠肺组织损伤的干预作用，考察了各组小鼠的血液生化指标，发现C2组、C3组小鼠的WBC，PLT，LYMPH，HCT，NEUT%水平均较B 组显著改善（P< 0.05），且呈量效正相关。提示应关注上述指标在肺损伤患者临床治疗过程中的变化。

综上所述，小儿柴桂退热口服液可改善LPS诱导的肺损伤模型小鼠的肺组织损伤，其作用机制可能与调控NF-κB介导的NLRP3通路有关。