广东紫珠标准汤剂制备及质量评价

向燕芬 邓桂珠 甘国兴* 卢 泳 龙国斌 朱卫星

1.广东省清远市中医院，广东 清远 511500；2.广东省鲜药民族医药工程技术研究中心，广东 清远 511500

广东紫珠是马鞭草科植物广东紫珠CallicarpakwangtungensisChun.的干燥茎枝和叶，具有收敛止血、散瘀、清热解毒的功效[1]。目前有关于广东紫珠化学成分、药理作用、质量标准等方面的研究报道[2-7]，但是没有关于广东紫珠标准汤剂的研究报道。本研究制备广东紫珠标准汤剂并评价其质量，为广东紫珠不同的饮片用药形式之间剂量换算提供参考，提高临床用药的准确性和疗效的一致性。

1 材料

1.1 仪器设备 e2695高效液相色谱仪(美国沃特世公司)，XS205型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，FE28型pH计(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)， RE-2000A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，等。

1.2 试剂与药材 连翘酯苷B对照品(成都曼斯特生物科技有限公司，纯度98.46%，批号：MUST-20111105)，色谱纯磷酸为上海麦克林生化科技有限公司产品；色谱纯乙腈及分析纯甲醇均为广州化学试剂厂产品；超纯水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)；广东紫珠药材在集贸市场收集。

2 方法与结果

2.1 广东紫珠标准汤剂制备 收集10批广东紫珠药材，参考《中药饮片标准汤剂研究策略》[8]的方法，分别称取广东紫珠药材100 g，置于3000 mL圆底烧瓶中，加入10倍量水，浸泡30 min，加热回流提取30 min，趁热用200目筛过滤，药渣加8倍量水，加热回流提取20 min，趁热用200目筛过滤，合并2次滤液，旋转蒸发仪60 ℃减压浓缩至500 mL，即得0.2 g·mL-1的广东紫珠标准汤剂。

2.2 广东紫珠标准汤剂pH测定 采用pH计测定10批广东紫珠标准汤剂的pH，重复3次，取平均值为广东紫珠标准汤剂的pH。10批广东紫珠标准汤剂的pH为4.4～5.3，平均pH为4.6。结果见表1。

2.3 广东紫珠标准汤剂出膏率 精密量取广东紫珠标准汤剂25 mL,置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，置于电热鼓风干燥箱中105 ℃干燥3 h，移至干燥器中，冷却30 min，迅速称定重量，计算广东紫珠标准汤剂的出膏率，重复3次，取平均值为广东紫珠标准汤剂的出膏率。10批广东紫珠标准汤剂的出膏率为11.9%～26.1%，平均出膏率为21.8%。结果见表1。

表1 广东紫珠标准汤剂pH和出膏率

2.4 广东紫珠标准汤剂指纹图谱建立及评价

2.4.1 色谱条件 Phenomenex Gemini® C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，0～35 min，5%A，95%B；35～40 min，5%～9%A，95%～91%B；40～55 min，9%～10%A，91%～90%B；55～80 min，10%A，90%B；80～81 min，10%～11A，90%～89%B；81～91 min，11%A，89%B；91～92 min，11%～10%A，89%～90B；92～130 min，10%A，90 %B；130～131 min，10%～12%A，90 %～88%B；131～151 min，12%～13%A，88 %～87%B；151～175 min，13%～14%A，87 %～86%B；柱温25 ℃，流速1.0 mL·min-1，检测波长332 nm，进样量5 μL。

2.4.2 对照品溶液制备 取连翘酯苷B对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成浓度54.153 μg·mL-1，过0.45 μm的微孔滤膜，进样量5 μL。

2.4.3 供试品溶液制备 取标准汤剂10 mL，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，称定重量，超声30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.4 精密度试验 取同一供试品溶液，按2.4.1项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，结果各色谱峰相对保留时间的RSD均<1.0%，相对峰面积的RSD均<4.5%，表明仪器具有良好的精密度。

2.4.5 稳定性试验 取同一供试品溶液，按2.4.1项下色谱条件分别在0 h、4 h、8 h、12 h、20 h、24 h测定，记录色谱图，结果表明各色谱峰相对保留时间的RSD均<1.0%，相对峰面积的RSD均<4.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.6 重复性试验 取同一标准汤剂样品6份，按2.4.3项下方法制备供试品溶液，2.4.1项下色谱条件测定，结果各色谱峰相保留时间的RSD均<1.1%，相对峰面积的RSD均<4.8%，表明该方法的重复性良好。

2.4.7 指纹图谱分析 将10批广东紫珠标准汤剂供试品按2.4.1项下色谱条件进样，记录色谱图。利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”(2012版)，采用中位数法和多点矫正法，时间宽度0.9 min，生成相应的对照指纹图谱1，其中共有峰10个，通过对照品指认出8号峰为连翘酯苷B。相似度分析结果表明，10批广东紫珠标准汤剂与对照指纹图谱相似度均大于0.90，符合标准汤剂指纹图谱相似度要求(大于0.90)。结果见表2，如图1。

表2 10批广东紫珠标准汤剂指纹图谱相似度

A.广东紫珠标准汤剂HPLC指纹图谱；B.连翘酯苷B对照品色谱图；C.对照指纹图谱

2.4.8 指纹图谱聚类分析(HCA) 采用 SPSS 26.0 数据分析软件，对10批广东紫珠标准汤剂共有峰的相对峰面积进行系统聚类，采用组间联接法，测量区间为欧氏距离，聚类结果见图2，10批广东紫珠标准汤剂可分为2类，GX1、GX2、GX3、GX4、GX5、GX6、GX7为第1类，GD1、GD2、GD3为第2类。

图2 10批标准汤剂的HCA树状图

2.4.9 主成分分析(PCA) 选择10批广东紫珠标准汤剂的10个共有峰的峰面积为变量，导入 SIMCA-P+12.0软件进行 PCA 处理，得分矩阵图见图3。结果发现 10 批样品聚为2组，GX1、GX2、GX3、GX4、GX5、GX6、GX7为一组，GD1、GD2、 GD3为第2组，与 HCA 结果一致。

图3 10批广东紫珠标准汤剂的PCA得分

2.4.10 正交偏最小二乘法判别分析 (OPLS-DA) 将10批广东紫珠标准汤剂的10个共有峰的峰面积导入 SIMCA-P+12.0软件进行OPLS-DA处理，得分矩阵图如图4。结果发现 10 批样品聚为2组，GX1、GX2、GX3、GX4、GX5、GX6、GX7为一组，GD1、GD2、 GD3为第2组，且与 PCA 和 HCA 结果一致。图5中的点离原点越远，表明对应变量(色谱峰)权重值越大，结合以变量重要性投影(VIP)值>1 为判定标准，筛选差异组分，如图6。结果共找到1个已知成分连翘酯苷B。

图4 10批广东紫珠标准汤剂的OPLS-DA得分矩阵图

图5 10批广东紫珠标准汤剂的OPLS-DA载荷散点图

图6 10批广东紫珠标准汤剂OPLS-DA的VIP值图

3 讨论

3.1 标准汤剂制备 《中药饮片标准汤剂研究策略》中要求药材样品需具有代表性，收集的药材样品应不少于10批，尽可能包括不同产区的药材样品。本研究收集广东紫珠药材10批，其中广西产7批、广东产3批，未能收集到湖南和江西产的药材样品。《中药饮片标准汤剂研究策略》中要求采用加热回流提取和减压浓缩的方法制备标注汤剂。因此，根据广东紫珠药材的特点，选择浸泡时间为30 min，采用加热回流提取，第一次加10倍量水，提取30 min，第二次加8倍量水，提取20 min，合并滤液后减压浓缩制备标准汤剂。

3.2 标准汤剂质量评价 《中药饮片标准汤剂研究策略》中要求以pH、出膏率范围、成分转移率范围、指纹图谱或特征图谱等指标评价标准汤剂质量。本研究中，10批广东紫珠标准汤剂的pH为4.4～5.3，平均pH为4.6，符合《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》中各批次值在均值加减3倍SD范围的要求；出膏率为11.9%～26.1%，平均出膏率为21.8%，广东产的出膏率均低于广西的；各批次标准汤剂指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.90，符合《中药饮片标准汤剂研究策略》中相似度不低于0.90的要求。由于在药店和医疗机构无法买到广东紫珠饮片，本研究所用广东紫珠的种植时间和存放时间均无法确定，其指标成分含量可能存在较大差异，所得成分转移率范围没有指导意义，因此本研究未测定广东紫珠中连翘酯苷B和金石蚕苷的含量，计算其成分转移率。

3.3 指纹图谱条件选择 本研究根据2020年版中国药典第一部，考察了265 nm、254 nm和332 nm 3个检测波长，发现以332 nm为波长，色谱峰数量较多，面积较大，色谱图基线最佳。在332 nm检测波长下，分别考察了甲醇-0.05%甲酸水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.05%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水等流动相的色谱图情况。甲醇-0.05%甲酸水、甲醇-0.1%磷酸水为流动相，色谱图峰数量较少，峰形较差，基线较差，色谱峰分离度较差。乙腈-0.05%甲酸水为流动相，色谱图峰形较好，但峰面积较大的色谱峰分离度较差。乙腈-0.1%磷酸水为流动相，色谱图基线平稳，色谱峰数量较多，色谱峰分离度较好，故选择乙腈-0.1%磷酸水为广东紫珠标准汤剂指纹图谱的流动相。

本研究参考《中药饮片标准汤剂研究策略》的要求制备了10批广东紫珠药材标准汤剂，并以pH、出膏率、指纹图谱等为指标进行评价。但是由于在药店和医疗机构无法买到广东紫珠饮片，本研究收集的广东紫珠产地较少，也没有测定广东紫珠指标性成分连翘酯苷B和金石蚕苷的含量，计算化学成分转移率，存在一定的不足。今后如果能收集到合适的广东紫珠饮片，将进一步补充完善相关研究，使结果更加科学合理。