P因子介导的C5a/C5aR轴活化在IgA肾病肾脏足细胞损伤中的作用

丁苗慧，张 颖，李 远，周雅丽，邢国兰

郑州大学第一附属医院肾内科 郑州450052

IgA肾病是导致终末期肾衰的常见原发性肾小球疾病[1-2]。蛋白尿是影响IgA肾病进展及预后的最主要因素之一，也是临床治疗的重点。目前大量糖皮质激素及免疫抑制剂的应用副作用大，且并未收到很好疗效。既往有研究[3]显示肾小球疾病的蛋白尿与足细胞损伤有直接关系；有学者[4]发现足细胞足突融合、去分化及脱落是导致蛋白尿、肾小球硬化及滤过衰竭的主要原因。因此，研究足细胞损伤机制对于延缓IgA肾病进展及改善预后意义重大，也有望为IgA肾病蛋白尿的治疗提供新思路。近年大量研究[5]证实补体激活参与IgA肾病的发病及进展。目前补体激活在足细胞损伤中的作用机制研究主要集中在膜攻击复合物C5b-9相关的分子途径[6-7]。依库珠单抗是一种结合C5的单克隆抗体，可以抑制C5的裂解进而减少C5b-9的形成。既往有研究[8]报道快速进展的IgA肾病患者在接受依库珠单抗治疗后蛋白尿减少、肾功能好转。P因子是补体活化的正向调节因子 ，有研究[9]发现75%～100%的IgA肾病患者肾组织中有P因子沉积。近年研究[10]显示，糖尿病肾病患者肾脏的足细胞上C5aR表达明显上调，说明C5a/C5aR轴活化在肾脏足细胞损伤中发挥了重要作用，因此推测C5a/C5aR过度活化也参与了IgA肾病足细胞损伤的发生。本研究将从P因子介导C5a/C5aR轴活化这个新视角揭示IgA肾病足细胞损伤的发病机制，为IgA肾病大量蛋白尿的临床治疗开拓新的思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2014年9月至2019年9月在郑州大学第一附属医院住院的IgA肾病患者，均经肾穿刺活检病理结果(包括光镜和电镜)证实。排除标准：①伴有急性(亚急性)肾小管损伤、急性(亚急性)间质性肾炎。②合并有其他原发性、继发性及遗传性肾小球疾病。③合并自身免疫性疾病、糖尿病、肿瘤、感染、妊娠、药物等与补体活化相关的疾病。④既往曾应用激素及免疫抑制剂治疗。共入选60例患者，再根据24 h尿蛋白定量分为少量蛋白尿IgA肾病组(24 h尿蛋白定量<1 g)、中量蛋白尿IgA肾病组(24 h尿蛋白定量1～3.5 g)、大量蛋白尿IgA肾病组(24 h尿蛋白定量>3.5 g)各20例(取肾穿刺活检后的剩余标本进行本次研究)。

同时收集在本院行肾脏肿瘤切除术的20例患者的远离肿瘤组织5 cm以上、病理诊断为正常的肾组织作为对照1组。选取20例体检健康的成人血清及尿液样本作为对照2组。本研究获得该医院伦理委员会审批同意，研究对象均签署知情同意书。

1.2 大量蛋白尿IgA肾病组肾组织中足细胞损伤程度的电镜检查将大量蛋白尿IgA肾病组患者肾组织和对照1组的标本用体积分数4%戊二醛固定4 h，PBS浸洗；体积分数1%锇酸固定90 min，PBS浸洗；丙酮脱水、浸透，包埋、切片。将厚70 nm的切片置于铜网上，于醋酸铀染液中室温染25 min，蒸馏水洗净后滤纸吸干，再置于柠檬酸铅染液中室温染20 min；蒸馏水洗净滤纸吸干透射电镜下观察。

1.3 肾组织中足细胞凋亡的Tunel与裂隙膜蛋白Nephrin的共染观察将石蜡固定的肾组织按3 μm厚连续切片，60 ℃烤片，常规脱蜡、水化，PBS浸洗，50 mg/L蛋白酶K消化，室温湿盒中放置10 min，PBS浸洗；滴加兔抗人Nephrin多克隆抗体(按1∶50稀释，英国Abcam公司)，4 ℃过夜，PBS浸洗；加二抗Cy3标记的羊抗兔IgG(按1∶50稀释，武汉三鹰生物技术有限公司)，37 ℃避光孵育1 h；滴加Tunel反应液(长沙爱科博生物科技有限公司)在37 ℃湿盒中避光孵育1 h；加2×SSC溶液终止反应，PBS浸洗，甘油封片，荧光显微镜下观察。

1.4 大量蛋白尿IgA肾病组肾组织中P因子或C5aR、C5b-9与Nephrin共表达的免疫荧光检测将石蜡固定的肾组织按3 μm厚连续切片，常规脱蜡、水化，PBS浸洗，高温高压热修复，胰酶修复；同时滴加小鼠抗人P因子或C5aR、C5b-9单克隆抗体(均按1∶50稀释，美国Santa Cruz公司)、兔抗人Nephrin多克隆抗体(按1∶50稀释，英国Abcam公司)，4 ℃湿盒过夜，滴加FITC标记的羊抗鼠IgG、Cy3标记的羊抗兔IgG(均按1∶50稀释，武汉三鹰生物技术有限公司)37 ℃避光孵育1 h，PBS浸洗，甘油封片，荧光显微镜下观察。

1.5 血清及尿液中P因子水平的ELISA法测定血清标本采集后立即在4 ℃下1 500×g离心10 min，收集上清液于EP管中，与尿液均置于-80 ℃冰箱备用。严格按照ELISA试剂盒(荷兰Hycult Biotech公司)说明书进行测定(由于尿P因子水平受尿液浓缩稀释因素影响，因此利用尿肌酐对尿液P因子水平进行校正)。

1.6 统计学处理采用SPSS 22.0进行数据分析。应用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组血清、尿液中P因子水平的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 大量蛋白尿IgA肾病组肾脏组织中足细胞形态的电镜观察结果见图1。由图1可知，电镜下可见大量蛋白尿IgA肾病患者肾组织中足细胞足突弥漫融合。

A：对照1组；B～D：大量蛋白尿IgA肾病组，红色箭头示足细胞足突融合，黄色三角示系膜区电子致密物沉积

2.2 各组肾组织中足细胞凋亡的共染结果见图2。凋亡细胞核呈现绿色荧光灶，Nephrin阳性细胞呈现红色荧光灶。由图2可知，大量蛋白尿IgA肾病组肾组织中Nephrin免疫荧光强度减弱，提示存在足细胞损伤；大量蛋白尿IgA肾病患者肾组织的凋亡足细胞较对照1组增多。

图2 各组肾组织Tunel与Nephrin免疫荧光共染结果

2.3 大量蛋白尿IgA肾病组和对照1组肾组织中P因子或C5aR、C5b-9与Nephrin共染结果见图3～5。

图3 大量蛋白尿IgA肾病组与对照1组肾组织中P因子与Nephrin免疫荧光共染结果

图4 大量蛋白尿IgA肾病组与对照1组肾组织中C5aR与Nephrin免疫荧光共染结果

图5 大量蛋白尿IgA肾病组与对照1组肾组织中C5b-9与Nephrin免疫荧光共染结果

绿色荧光标记的P因子或C5aR、C5b-9与红色荧光标记的Nephrin在肾小球足细胞上重合为黄色荧光，结果表明P因子或C5aR、C5b-9与Nephrin在大量蛋白尿IgA肾病患者肾组织的足细胞上存在共定位，足细胞上P因子或C5aR、C5b-9的沉积明显强于对照1组。

2.4 各组血清、尿液中P因子水平的比较结果见表1。由表1可知，大量蛋白尿IgA肾病组血清P因子水平高于对照2组、少量及中量蛋白尿IgA肾病组。少量及大量蛋白尿IgA肾病组尿液P因子/尿肌酐水平高于对照2组，大量蛋白尿IgA肾病组升高的更为明显。

表1 各组血清、尿液中P因子水平的比较

3 讨论

IgA肾病起病隐匿，临床表现多种多样，目前发病机制尚不完全清楚，约40%的IgA肾病患者在发病20 a后进展为终末期肾病[11]。蛋白尿是影响IgA肾病进展及预后的最主要因素之一。肾小球滤过屏障是由排列在毛细血管内的内皮细胞、肾小球基底膜和足细胞组成，足细胞是肾小球中高度特化的上皮细胞，足细胞裂隙膜蛋白是调节足细胞结构和功能的多蛋白复合体，可以影响肾小球滤过膜的通透性及蛋白尿的产生。目前较为公认的IgA肾病发病机制是IgA1免疫球蛋白与其抗原结合形成免疫复合物并在肾小球系膜区聚积，通过激活补体旁路途径或凝集素途径引发炎症反应，进而造成肾脏损伤[12-13]。

补体系统是人体重要的免疫防御系统，P因子是补体旁路途径的唯一正向调节因子，能稳定补体旁路途径激活过程中的C3转化酶C3bBb，C3bBb可裂解C3为C3a和C3b，C3b参与形成C5转化酶，进一步裂解C5形成C5a和C5b。C5a是补体活化过程中产生的主要致炎物质，C5a与其特异性受体C5aR结合，从而促进肾组织中炎症反应的发生、发展[14-15]；C5b则与另外4种补体蛋白(C6、C7、C8、C9)结合形成膜攻击复合物C5b-9，C5b-9通过破坏细胞的完整性引起细胞损伤和组织炎症，进而导致肾脏损伤。

Nephrin是一种重要的足细胞裂隙膜蛋白，本研究结果显示大量蛋白尿IgA肾病患者肾脏组织中足细胞足突弥漫融合，足细胞凋亡数量增多，证实IgA肾病确实存在足细胞损伤和凋亡。

P因子可以作为血清、尿液或肾组织中IgA肾病的生物标志物，用于预测可能发展为大量蛋白尿或严重肾功能不全的IgA肾病患者[16]。免疫荧光染色结果显示：大量蛋白尿IgA肾病患者肾组织中足细胞上P因子的沉积增强，说明P因子参与了IgA肾病足细胞的损伤。ELISA检测结果显示：大量蛋白尿IgA肾病患者血清及尿液中的P因子水平均高于对照2组，提示在全身循环系统及肾脏局部均有补体旁路途径的过度活化。

依库珠单抗是一种选择性抑制C5的单克隆抗体，能抑制C5a释放和C5b-9形成，目前已有一些使用依库珠单抗治疗IgA肾病的成功案例[17]；Avacopan又称CCX168，是一种口服给药的选择性C5aR抑制剂，通过与C5aR结合阻止破坏性炎症细胞对C5a激活产生反应，研究显示C5aR抑制剂与大剂量糖皮质激素具有类似的疗效，可以用于治疗ANCA相关性血管炎肾损害[18]；Zhang等[19]通过动物实验发现抑制C5aR可能是治疗IgA肾病的有效措施。

免疫荧光染色结果还显示：大量蛋白尿IgA肾病患者肾组织足细胞上C5aR的表达和C5b-9的沉积较对照1组增强，表明补体C5a/C5aR活化与IgA肾病足细胞损伤密切相关；C5a单克隆抗体和C5aR抑制剂可以减轻由C5a-C5aR轴活化介导的炎症反应，从而延缓IgA肾病的进展。

综上所述，C5a/C5aR轴过度活化可能参与了IgA肾病肾脏足细胞损伤的发生。以上研究提示补体抑制治疗可能是预防和减少IgA肾病中肾小球足细胞损伤的潜在治疗方案，后续我们也将试验性应用依库珠单抗治疗难治性IgA肾病。