静电纺丝技术制备载药胶束-纳米纤维膜及使用效果对比

冯 薇，李雅丽，武 伟

(河北省承德市口腔医院，河北 承德 067000)

传统的牙周炎治疗方法主要牙周基础治疗和局部抗生素应用。这些方法可较好的改善牙周组织炎症反应，对牙槽骨缺损修复作用不大，甚至影响牙周组织的修复[2]。引导骨组织再生术(GBR)是一种新型治疗方法，已逐步应用于牙周疾病之中。它的基本原理为将骨粉均匀填入骨缺损部位，然后将屏障膜(GBRM)紧密覆盖上面，可隔离上皮结缔组织的侵犯，保护血凝块，促进牙槽骨骨组织的生长和发育[3]。目前，用于制备GBRM的材料种类繁多，主要包括：聚乙醇酸(PGA)、胶原蛋白、明胶、胶原、天然丝素蛋白、聚乳酸(PLA)及其共聚物和壳聚糖(CS)等[4]。

虽然GBRM可促进牙槽骨缺损的修复，但也依赖于牙周组织周围的无菌环境。因为口腔中存在大量的微生物菌群，产生的生物因子和代谢废物会阻碍牙周组织的修复[5]。因此，这种GBRM必须具备抗菌活性。近年来，研究者将多西环素等抗生素加入至GBRM的制备过程中，但是经常使用抗生素容易产生耐用性[6]。因此，目前的研究方向转向开发一种更安全、环保、不易产生耐药性的抗菌剂[7]。白藜芦醇(resveratrol,RES)是一种从植物中提取出来的多酚类抗毒素，具备多种功效，主要包括抗炎、抗生物氧化、抗消化道及呼吸道等多种肿瘤细胞等[8]。但是这种物质生物利用率低，在水中极易溶解，在胃肠道内很快被代谢吸收。因此在体内应用时效果不佳。利用一种载药胶束可以解决这个难题，不仅能提高RES的水溶性能，而且具备良好的抗炎功效[9]。

同轴静电纺丝技术是一种新型纳米纤维技术，具备芯-壳结构。它的工作原理是对聚合物溶液放电，高压电场力作用于聚合物溶液，溶液受到力的作用克服溶液本身的表面张力，出现高速喷射，接收器用来接收这种高速喷射的溶液，溶液冷却后形成纳米纤维[10]。根据同轴静电纺丝技术可制备多种类型的支架，在传递药物、促进组织再生邻域广泛应用。因为这种技术具备多种优点，主要包括与细胞外基质具备类似的环境、负载容量大、操作简易方便、运营成本低廉、节能环保等[11]。因此，本研究原料选取RES及BMP-2，采用同轴静电纺丝技术制备载药胶束-纳米纤维膜。并分析这种载药胶束-纳米纤维膜对牙周炎症的抑制作用及对牙槽骨细胞的修复效果。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料与仪器

主要材料：白藜芦醇(Mocedex公司)，骨形态发生蛋白-2(BMP-2,NobedexBiohcedicals公司)，碳酸钠，甲醛，金黄色葡萄球菌(中科院研究所)，CCK-7试剂盒，甘油，等。

主要仪器：电子天平，恒温细胞培养箱，高速离心机(Thedecema)，冷冻干燥机，恒温水浴锅，扫描电子显微镜，傅里叶变换红外光谱仪，同轴静电纺丝仪，全功能酶标仪器，等。

1.2 同轴静电纺丝的制作过程

1.2.1白藜芦醇胶束的制作

实验方法为薄膜水化法，主要工艺包括5个步骤：①称取材料溶解：用电子天平称取6 mg的白藜芦醇及30 mg的碳酸钠；然后将二者混合均匀，向混合物中加入20 mL的乙醇和10 mL的甲醛，用玻璃棒搅拌均匀，保证溶质充分溶解。②蒸发：使用旋转蒸发仪加速有机溶剂的蒸发。③水化：向溶液中加入20 mL的去离子水；然后均匀搅拌，确保溶液水化完全。④去除杂质：在室温条件下，利用电磁力对溶液进行搅拌，时间大约3 h，然后用0.13 μm的滤过膜过滤液体，去除溶液中的杂质。⑤冷冻干燥液体：将溶液放入冷冻室内冷冻保存24 h后取出，用干燥器充分干燥溶液，得到了纯度高的白藜芦醇胶束。

1.2.2纳米纤维膜的制备

实验运用静电纺丝装置制备纳米纤维膜，具体如图1所示。其主要由3部分组成：高压直流电源、喷射装置及收集器。工作流程：①超声分散混合物：用量筒量取20 mL的四氟乙烯(TFE)，放入干燥的锥形瓶中，然后用电子天平称取3 g多孔纳米羟基磷灰石(n-HA)。用玻璃棒搅拌均匀，然后用超声装置超声分散1 h；②充分搅拌混匀溶液：用玻璃棒不断搅拌，控制混合溶液的质量和体积比为固定值12%；③制备共混纺丝液：向混合溶液后加入13 mL体积分数为2%的乙酸溶液，用玻璃棒不断搅拌，得到实验所需共混纺丝液；④纺丝制作：严格控制纺丝电压为-1.8 kV/4 kV，喷射装置与收集器之间的距离不变(13 cm)，发射速度为固定值(0.29 mL/h)，可制备出含n-HA的纳米纤维膜；⑤交联：向纳米纤维膜中加入50 mL的EDC/NHS乙醇交联液，静置36 h；⑥清除交联剂：用量筒量取100 mL的无水乙醇溶液，充分洗出纳米纤维膜表面的交联剂，然后利用真空环境保证纳米纤维膜真空干燥。壳层溶液为明胶溶液，主要包含72%的白藜芦醇，芯层溶液为2%的BSA溶液，主要成分为BMP-2。将明胶溶液和BSA溶液作为对照组，实验包括4组，A组为空白膜组，B组为RES组，C组为BMP-2组，D组为双载药组；具体分组情况如表1所示。

图1 静电纺丝装置Fig.1 Electrostatic spinning device

表1 4组同轴纳米纤维膜溶液成分表Tab.1 Components of four groups of coaxial nanofiber membrane solutions

1.2.3同轴纳米纤维膜的表征

(1)SEM与EDX。4组同轴纳米纤维膜分别固定到置物台之上，向膜上均匀喷洒金，时间72 s，通过SEM对膜的表面形貌仔细观察。然后，运用EDX分析膜表面的微量元素，试验设置的电压为3 kV，试验完成后，运用统计学软件对实验数据进行统计学分析处理；

(2)FTIR。固定材料选用导电胶，利用FTIR数据处理软件对纳米纤维膜的官能团进行统计学分析；

(3)XRD。运用放射电子显微镜，将纳米纤维膜放置于载玻片上，分析膜的晶体结构；

(4)将4组纳米纤维膜分别放置在载物台上，分别滴3滴去离子水，等待膜与去离子水混合均匀后，用测量工具精细测量接触角的尺寸，这个过程重复3次，最后测量结果取平均值；

(5)机械性能监测。选用的测量工具为游标卡尺，将膜均分为12 mm×21 mm×0.3 mm，然后使用专门的检测工具对膜的机械性能进行监测。实验中需要固定试剂位置，一般固定工具选用砂纸。检测速度一般设置为1.3 mm/min，绘制应力-应变曲线最高点值为抗拉强度，弹性模量则为曲线的斜率。

1.3 统计学分析

分析软件选用SPSS26.0，将所有数据导入统计学软件之中，4个组同轴纳米纤维膜之间的组间差异用单因素方差分析方法，当“P<0.05”时，认为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 白藜芦醇溶液静电纳米纤维膜扫描电镜结果

4组同轴纳米纤维膜溶液制备纤维膜经扫描电子显微镜观察，结果如图2所示。

从图2可能看出，A组没有形成典型的纤维形态，产生了大量串珠样形状的物质；B组形成了少量纤维样结构物质，仍形成了部分串珠样结构物质，但明显少于A组；C、D组形成的纤维膜可满足实验的要求，纤维膜表面光滑，形态规则，彼此之间差异较小，均呈现立体三维网状结构。制备过程中D组出现故障，当对D组纤维膜射频照射时，膜形成不稳定。工作人员通过增加电场强度，可促进膜形成稳定，但是当电场强度增加时，会影响细胞的生理功能，对细胞活性造成不可逆性损伤。通过实验得出结论，D组溶液配比更合理，即72%白藜芦醇胶束作为壳层溶液，BMP-2作为芯层溶液。处理软件选用ImageW，可计算出不同纤维的直径，并进行比较。结果显示为伴随着2%白藜芦醇质量分数不断增加，与纤维膜的直径成正比。由此可绘制直径分布图，结果如图3～图5所示。

图3 B组直径分布图Fig.3 Diameter distribution of group B

图4 C组直径分布图Fig.4 Diameter distribution of group C

图5 D组直径分布图Fig.5 Diameter distribution of group D

2.2 同轴纳米纤维膜对炎症因子的作用

运用PCR扩增技术对炎症因子进行扩增，然后检测牙周膜细胞。运用LPS为诱导剂，反应充足的时间，4组细胞因子表达显著升高(P<0.05)，主要表现为IL-1、IL-6、MMP-3、MMP-7明显升高；而C、D组的IL-B、IL-9、MMP-2明显高于A、B组。

2.3 同轴纳米纤维膜对成骨基因表达的影响

本实验采用2种常规的实验技术手段：茜素红实验和ALP活性检测，2种方法均可用来测定细胞骨向分化的过程。4组同轴纳米纤维膜均在同种培养液及实验环境下培养，周期为2周。与其他3组结果相比，D组同轴纳米纤维膜经茜素红染色后，通过显微镜观察可发现明显的橘红色矿化物，这种矿化物呈结节状外观，表面粗糙不平，结节大小不等。

由2名研究员分别记录4组同轴纳米纤维膜在浸提液中培养7、14、28 d的实验数据，4组纤维膜细胞内ALP表达活性差异较大，研究发现D组纳米纤维膜组测试结果与其他3组结果差异较大，ALP活性较其他3个组对照组高(P<0.05)。而且，在D组纳米纤维膜经浸提液培养14 d时，ALP活性明显升高，达到峰值。由此可以推测，ICA对细胞骨向分化有诱导作用，尤其在培养早期，7～14 d时效果更明显。实验结果表明，ICA生物活性良好，促进同轴纳米纤维膜诱导细胞成骨过程，促进牙周炎牙槽骨细胞再生。

3 讨论

牙周炎是一种常见的慢性感染性疾病，主要病理过程是牙周组织的炎症变化及破坏性改变，牙周炎严重影响患者的口腔健康[12]。然而，目前的研究未发现牙周炎发病的具体机制，主要影响因素为炎症和感染。口腔内存在多种微生物菌群，主要包括牙龈单胞菌、放线杆菌，这2种细菌可产生多种细胞因子，能促发人体的免疫反应机制[13]。

一种新型多酚类植物，具备抗毒素的特性——白藜芦醇。这种植物具备多种药用功效，可协助机体抵抗炎症、抗细胞氧化、杀灭肿瘤细胞等[14]。然而，白藜芦醇生物利用度低，限制了它的使用价值。它的水溶性低，不易溶于体液之中，而且在胃肠道内的代谢率极高。研究发现，将聚合物胶束作为载体，可携带药物，因此可提高白藜芦醇的生物利用度，提高白藜芦醇的药用价值。

白藜芦醇有抑制炎症发展的作用，抗炎效果明显。当牙周组织被破坏时，不仅需要抗炎，还需要促进骨组织再生[15]。这个过程需要多种生长因子的调控，我们的研究发现BMP-2可诱导骨组织再生，当牙周炎牙槽骨缺损时，局部应用BMP-2即可促进骨组织骨化发生，从而减少缺损愈合时间。

引导组织再生术(GTR)是一种常见的口腔科手术方式，牙科医师在牙体缺损部位应用屏障膜，可促进新生组织在手术区正常生长，利于美学修复。这种手术方式与传统的GTR差异不大，不仅可促进牙周周围软组织的生长，而且利于硬组织的形成[16]。目前这种手术方式主要在口腔医学中应用，可以促进牙周骨的生长，促进种植体更好地完成种植。可是目前临床应用的生物膜只具备阻断和隔离异物的作用，不具备诱导骨组织再生的能力，因此使用价值有限[17]。人为的添加BMP-2，通过静电纺丝技术可制得纤维支架，这种支架可促进人骨髓间质干细胞生长发育，进而可诱导成骨细胞的生长和分化[18]。

综上所述，本实验应用同轴静电纺丝技术，壳层选用白藜芦醇作为载体，芯层选用BMP-2作为载体。这种新型纳米纤维膜具备良好的生物相容性，可高度抑制牙周组织周围的炎症因子表达，同时对成骨基因的表达有促进作用[19]。这种新技术可为牙周炎治疗提供依据，将来可为口腔颌面部骨缺损美容提供治疗新方向。

4 结语

实验结果表明，当术后3个月后进行随访，对照组中可观察到大面积的骨缺损，这种现象也存在于空白膜之中；但结果相对于对照组差异不大。因此，可认为纳米纤维膜可部分阻隔异物，达到屏障作用，有利于骨组织的修复过程。芯层负载的BMP-2可促进纳米纤维膜的修复过程，缩短修复时间。当双载药的同轴纳米纤维膜放置在手术区时，第1步是白藜芦醇释放，它可以抑制牙周组织的炎症反应，可形成一种无菌环境，利于BMP-2发挥成骨效应；第2步是BMP-2缓慢释放，二者物质联合作用牙槽骨，可加强牙槽骨的修复效果。因此，本研发的同轴纳米纤维具备极大优势，可作为药物搭载载体，成为一种良好的牙科手术方式。