独脚金内酯对干旱胁迫下黑果枸杞种子萌发和幼苗生理变化的影响

刘淑兰，李 进，马永慧，巫利梅，李 莹，朱丽春

(新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室，干旱区植物逆境生物学实验室，新疆师范大学生命科学学院，新疆 乌鲁木齐 830054)

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)为茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium)多年生灌木[1]，在我国仅分布于西北地区，是我国干旱区重要的野生药食两用植物资源[2]，属国家二级保护植物[3]。黑果枸杞常生于盐碱化荒漠草原，其叶片、果实等可作为饲料供骆驼、羊等牲畜食用[4]，同时又具有水土保持、防风固沙、土壤改良等生态价值，是世界上三大碱性土壤指示植物和先锋植物之一[5]。在黑果枸杞的人工种植中，人们发现其种子萌发和幼苗生长阶段易受干旱的不良影响，对生产造成了一定损失[6]，为此，积极寻求黑果枸杞抗旱途径和方法对提高其在干旱环境下的种子萌发和幼苗生长具有重要意义。

近年来，人们在外源调节物质促进种子萌发、提高植物抗旱性方面进行了系列研究，如：肖珍珍等[7]研究发现褪黑素浸种能够有效缓解干旱胁迫对无芒雀麦(Bromusinermis)种子萌发的抑制作用；李颖等[8]研究发现水杨酸和脱落酸浸种有助于低温下扁蓿豆(Medicagoruthenica)种子的萌发以及幼苗的生长。独脚金内酯(Strigolactones,SLs)是一类新型植物激素[9]，国内外研究发现SLs除了具有抑制植物分枝、侧根生长、促进叶片衰老等作用外[10]，还在抵御生物胁迫和非生物胁迫方面(如盐旱胁迫及营养元素缺乏等)具有显著作用[11]。关于SLs提高植物对非生物胁迫的抗性研究主要集中在生理调节方面，如缓解油菜(Brassicanapus)渍水胁迫[12]，缓解大麦(Hordeumvulgare)镉毒害[13]，通过调控基因表达促进油菜生长、光合作用和缓解盐胁迫下的氧化应激等[14]。目前独脚金内酯对黑果枸杞在干旱胁迫下的影响还未见报道，本研究通过聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG-6000)模拟干旱[15]对黑果枸杞种子及幼苗进行胁迫处理，设置不同浓度的SLs，探究SLs对黑果枸杞种子萌发及幼苗生理特性的影响，筛选出干旱地区黑果枸杞种植施用的最佳SLs溶液浓度，旨在为黑果枸杞在新疆干旱荒漠地区的人工种植及其抗旱生理机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黑果枸杞种子于2020年采自新疆博湖县开都河流域(41°58.03' N，86°37.50′ E，海拔1 044 m)。开都河流域地处亚欧内陆荒漠，属暖温带典型荒漠气候，气候干燥、降水稀少。本研究在新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室进行。

1.2 试验设计

将种子放入40℃恒温水浴锅中使用蒸馏水浸种48 h，以解除种子休眠。配置75%乙醇，浸种后进行消毒处理10 min，蒸馏水冲洗干净后用吸水纸吸干种子表面水分待用[16]。

试验采用双因素设计。利用PEG-6000配制溶液，设置3个干旱胁迫浓度梯度(0%，10%，15%)，标记为：CK(对照)、D1(轻度干旱)、D2(重度干旱)。在现有SLs缓解植物逆境伤害研究中[12-14]其使用浓度范围为0.1～10 μmol·L-1，依此设置0，0.1，1，10，100 μmol·L-15个浓度进行预实验，确定本试验浓度范围为0.1～10 μmol·L-1，结合前人实验中的常用浓度，最后通过18 μmol·L-1的SLs母液配置6个外源独脚金内酯浓度梯度为：0，0.18，0.4，1，5，10 μmol·L-1。如表1所示，共18个处理，每个处理重复3次。

表1 外源独脚金内酯处理及干旱胁迫试验设计

1.2.1萌发试验设计 选择饱满、大小一致的干净种子，用不同浓度的SLs浸种12 h，0 μmol·L-1处理组用蒸馏水处理。采用培养皿双层滤纸法进行萌发，将经过处理的种子置于浸透了PEG溶液的滤纸上，以浸透滤纸并稍有剩余为宜，CK组施加等量蒸馏水。每个培养皿内(按“井”字法)均匀摆放30粒种子。将培养皿置于光照强度4 000 lx、光照时间12 h(10∶00—22∶00)，室温20～25℃条件下。萌发期间每天晚上用称重法补足质量，维持每3 d更换1次滤纸，每天观察记录种子萌发情况及发芽粒数。种子萌发以黑果枸杞种子露白作为标准，连续培养观察15 d，直至连续3 d无种子萌发视为试验结束。发芽结束后，各处理随机挑选10粒出芽种子使用游标卡尺测其主根长[16]。

1.2.2幼苗生长试验设计 选择饱满、大小一致的种子，播入规格为12.5 cm×7.5 cm×9 cm(上径×下径×高)白色塑料花盆中，每个花盆内有烘干土壤0.5 kg。将盆栽均放置在适宜环境条件下萌发、生长，挑选生长良好、长势基本一致的黑果枸杞幼苗，每盆5株，采取不进行浇水处理直至土壤水分自然消耗后，进行土壤干旱胁迫和SLs喷施处理[6]。根据梯度设计，干旱胁迫开始第0，6，12天晚上20：00向根部灌施PEG 100 mL，CK组施加等量蒸馏水。每天记录其质量，灌施期间以上一次施加PEG后质量为标准，定期浇水维持质量，胁迫周期共28天。干旱胁迫处理开始后的第1，4，7天进行外源SLs处理，每天晚上20：00向根部灌施20 mL SLs溶液，0 μmol·L-1处理组施加等量蒸馏水。

1.3 测定指标及方法

1.3.1发芽指标测定 发芽率(Germination rate，GR)、发芽势(Germination potential，GP)、发芽指数(Germination index，GI)、活力指数(Vigor index，VI)、相对根长的计算方法[16]如下所示。

发芽率=n/N，式中，n为总萌发种子数，N为供试种子总数。

发芽势=m/N，式中m为种子发芽高峰时的发芽个数，N为供试种子数。

发芽指数=Σ(Gt/Dt)，式中Gt为t日的萌发数，Dt为相应的萌发天数。

活力指数=相对根长×GI；相对根长=s/S，式中s为胁迫下根长，S为对照的根长。

1.3.2生理指标测定 基于1.2.2处理，分别采集胁迫第27 d黑果枸杞幼苗顶部完全展开功能叶，使用北京索莱宝科技有限公司试剂盒测定各生理指标。叶绿素使用无水乙醇与丙酮按体积比1∶2混合液提取[17]；脯氨酸(Proline，Pro)含量使用酸性茚三酮法测定[18],丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量通过硫代巴比妥酸法测定[19]，总抗氧化能力(Total antioxidant capacity，T-AOC)通过还原Fe3+-三吡啶三吖嗪测定[20]。

1.4 数据处理与分析

试验数据均使用Excel 2016进行计算整理，采用SPSS 26.0软件进行数据分析，结果采用均值±标准误表示。在α为0.05水平上，采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)比较干旱胁迫、外源SLs及二者交互作用对各项指标的影响和差异显著性，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行各处理平均值间各项指标的比较，采用Duncan多重比较进行差异显著性检验；采用Origin 2021绘图并对各处理平均值间各项指标进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 外源独脚金内酯对干旱胁迫下黑果枸杞种子萌发的影响

由表2可知，同一干旱胁迫程度下随着SLs浓度的升高，黑果枸杞种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数总体呈先上升后下降的趋势，CK组在使用较低浓度即0.18，0.4，1 μmol·L-1SLs浸种处理后，黑果枸杞种子的各项发芽指标均高于未施加SLs组。D1胁迫下，1 μmol·L-1SLs浸种处理后黑果枸杞种子的各项发芽指标均达到峰值，10 μmol·L-1SLs浸种后种子各项发芽指标均低于0 μmol·L-1处理组，表现为抑制作用。D2胁迫下，低浓度SLs浸种后发芽率、发芽指数、活力指数均高于0 μmol·L-1浓度SLs浸种处理组，且以1 μmol·L-1SLs浸种处理效果最好，10 μmol·L-1SLs浸种后种子发芽率、发芽势低于0 μmol·L-1浓度SLs浸种处理组，有一定抑制作用。未施加SLs时，随着干旱胁迫程度增加，黑果枸杞种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数总体呈下降趋势，其中D1胁迫对各项发芽指标影响较小，与CK处理差异不显著，D2胁迫时发芽率、发芽指数、活力指数显著下降(P<0.05)。由表3可知，干旱胁迫对黑果枸杞种子萌发影响显著(P<0.001)，而单独施加外源SLs以及在二者互作情况下对其萌发影响均不显著。

表2 外源独脚金内酯对干旱胁迫下黑果枸杞种子萌发的影响

表3 干旱胁迫、外源独脚金内酯处理及二者互作对黑果枸杞种子萌发和幼苗生理影响的双因素方差分析(F值)

综上说明在干旱胁迫下，低浓度SLs处理对种子萌发具有促进作用，高浓度SLs处理对种子萌发具有一定抑制作用。

2.2 干旱胁迫下施加外源独脚金内酯黑果枸杞叶片叶绿素含量变化

由表4可知，在同一干旱胁迫下，CK组幼苗在施加SLs后，其叶绿素a，b及叶绿素总含量均下降；D1组叶绿素a含量变化呈先上升后下降趋势，且增幅分别为47.22%，63.88%，79.07%，-24.06%，-30.25%，叶绿素b含量变化呈先上升后下降趋势且增幅分别是12.24%，25.77%，45.28%，-11.58%，-11.13%，均在施加浓度为1 μmol·L-1时达到峰值，说明低浓度SLs可提高黑果枸杞叶绿素含量，高浓度SLs则降低叶片叶绿素含量，此外低浓度SLs处理组可提高Chl(a/b)值，说明SLs使黑果枸杞倾向于合成叶绿素a从而提高光合作用；D2组叶绿素a，b含量变化整体呈先上升后下降趋势，增幅分别为-9.54%，6.37%，32.66%，28.43%，-33.39%和13.57%，18.63%，43.47%，54.25%，-17.44%，与D1组相比，增幅减小，但叶绿素含量均高于D1处理组。

表4 外源独脚金内酯对干旱胁迫下黑果枸杞叶片叶绿素含量的影响

施加0 μmol·L-1SLs时，D1和D2胁迫的叶绿素a，b含量与CK组相比增幅分别为-53.84%，-44.58%(D1)和34.99%，7.42%(D2)；施加0.4 μmol·L-1SLs处理组内，D1和D2处理的叶绿素a，b含量与CK组相比的增幅均高于施加0 μmol·L-1SLs处理组，分别为13.55%，-15.74%(D1)和115.55%，54.05%(D2)；施加1 μmol·L-1SLs处理组内，D1和D2处理的叶绿素a，b含量与CK组相比的增幅同样高于施加0 μmol·L-1SLs处理组，分别为-8.42%，-6.75%(D1)和98.42%，78.49%(D2)，说明在干旱胁迫时施加0.4和1 μmol·L-1SLs可缓解干旱胁迫对叶绿素的降解，提高叶绿素含量，增强光合作用。

根据表3双因素方差分析可知，干旱胁迫、施加外源SLs以及二者交互作用对叶绿素含量的影响显著(P<0.001)。

综上所述，施加低浓度SLs对干旱胁迫下黑果枸杞叶片叶绿素的合成有促进作用，1 μmol·L-1为最适浓度。

2.3 干旱胁迫下施加外源独脚金内酯黑果枸杞幼苗游离脯氨酸含量变化

由图1可知，CK组随着外源SLs浓度增加，Pro含量组内变化不显著，0.4 μmol·L-1浓度SLs处理时Pro含量最高；D1组随着外源SLs浓度的增加，Pro含量整体呈现先增后减的趋势，0.18，1 μmol·L-1浓度SLs处理与0 μmol·L-1浓度处理有显著差异(P<0.05)，当施加5，10 μmol·L-1高浓度SLs时，Pro含量较0 μmol·L-1SLs浓度处理降低51.06%，15.35%，说明低浓度SLs处理可提高黑果枸杞幼苗抗旱能力，高浓度SLs处理反而会减弱黑果枸杞幼苗抗旱能力；D2组随着外源SLs浓度的增加，Pro含量整体呈先增后减趋势，其它各浓度处理与0 μmol·L-1SLs处理组相比增加了2.1，1.7，3.5，2.1，1.4倍，且差异显著(P<0.05)，同样说明SLs处理可提高黑果枸杞幼苗抗旱能力，且低浓度SLs效果更好。

图1 外源独脚金内酯对干旱胁迫下黑果枸杞幼苗游离脯氨酸含量的影响

对于施加相同浓度外源SLs处理组，随着干旱胁迫程度增加，黑果枸杞幼苗Pro含量呈递增趋势，且胁迫程度越强Pro含量增幅越大，说明黑果枸杞自身能通过提高Pro含量来抵御干旱胁迫的伤害。不施加SLs时，D1和D2处理组Pro含量与CK组相比增加了1.6，2.4倍；施加0.18，0.4，1 μmol·L-1SLs，D1和D2胁迫处理组Pro含量增加了6.6/9.7倍，1.7/8.3倍和3.2/14.6倍，而施加高浓度即5 μmol·L-1，10 μmol·L-1SLs，D1和D2胁迫处理组Pro含量增加了0.28/1.2倍和9.9/7.2倍，相比之下在干旱胁迫时施加低浓度SLs，其Pro含量上升幅度更大。同样结合表3可知，干旱胁迫与外源SLs二者互作对黑果枸杞提高Pro含量以抵御干旱胁迫效果显著(P<0.01)。

以上结果说明施加1 μmol·L-1外源SLs，可提高干旱胁迫下黑果枸杞幼苗Pro含量以更好地抵御干旱。

2.4 干旱胁迫下施加外源独脚金内酯黑果枸杞幼苗丙二醛含量变化

如图2所示，CK处理组，施加0.18，5 μmol·L-1SLs，黑果枸杞幼苗MDA含量显著降低(P<0.05)；D1处理组，0.18，0.4 μmol·L-1SLs浓度处理后MDA含量略有下降；D2处理组，5 μmol·L-1SLs处理后的MDA含量有一定下降。在施加同一浓度SLs的处理组内，随着干旱胁迫加强，D1和D2与CK相比，MDA含量均降低且与CK差异显著(P<0.05)，但D1与D2之间差异不显著。由表3可知，干旱胁迫、外源SLs以及二者交互作用对MDA含量有极显著影响(P<0.001)。

图2 外源独脚金内酯对干旱胁迫下黑果枸杞幼苗丙二醛含量的影响

综上所述，干旱胁迫下施加外源SLs在一定程度上可缓解黑果枸杞幼苗中膜脂过氧化反应，降低MDA含量，减轻干旱胁迫对黑果枸杞的伤害。

2.5 干旱胁迫下施加外源独脚金内酯黑果枸杞幼苗总抗氧化能力变化

由图3可知，CK组随着施加外源SLs浓度增加，黑果枸杞幼苗T-AOC总体呈下降趋势；D1处理组随着施加外源SLs浓度增加，幼苗的T-AOC变化趋势呈现出先下降后上升趋势；D2处理组随着外源SLs浓度增加，幼苗T-AOC变化不明显。对于相同浓度外源SLs处理组，随着干旱胁迫程度增强，D1和D2与CK相比，黑果枸杞幼苗T-AOC上升，显著差异(P<0.05)。由表3可知，干旱胁迫对T-AOC有极显著影响(P<0.001)，但外源SLs及二者交互作用对T-AOC无显著影响。

图3 外源独脚金内酯对干旱胁迫下黑果枸杞幼苗总抗氧化能力的影响

以上结果说明在干旱胁迫下黑果枸杞可提高其总抗氧化能力以抵御干旱，在施加适宜浓度外源SLs后，对T-AOC也有一定的提高。

2.6 主成分分析

为了进一步研究SLs处理引起的差异，对18个处理下的发芽指标和生理指标数据进行主成分分析，结果如图4所示。根据主成分分析特征值大于1的原则，在原来11个指标的基础上提出2个主成分，累积贡献率达85.7%，包含了所测指标大部分信息，可以基本反映各处理对黑果枸杞影响的整体情况。

图4 外源独脚金内酯与干旱胁迫处理下黑果枸杞种子萌发、生理指标主成分分析

图中每个点代表不同的处理，各个点的标签值为所使用的外源SLs浓度。由图中样本点分布可知，干旱胁迫程度很明显地将各个处理区分开，在不同的干旱条件下施加外源SLs有不同的效果。CK处理组中施加0.18，1 μmol·L-1SLs在PC2轴得分为正且最高，10 μmol·L-1SLs处理在PC1和PC2轴得分均为负且最低；D1胁迫时施加1 μmol·L-1SLs在PC2轴得分为正且最高，10 μmol·L-1SLs处理在PC2轴得分为负且最低；D2胁迫下施加外源SLs在PC1轴上得分均为正，以1，5 μmol·L-1效果最好，在PC2轴上以1 μmol·L-1得分较高，而10 μmol·L-1SLs处理在PC1和PC2轴得分均为最低。综上所述，在干旱胁迫下施加1 μmol·L-1外源SLs能够更好地协助黑果枸杞抵御干旱胁迫，而10 μmol·L-1SLs对黑果枸杞的生长有抑制作用。

3 讨论

种子萌发是植物生长周期的开始，也是植物在其生活史的关键时期，在这一阶段易受环境中水分影响，干旱胁迫对种子的萌发有明显的抑制作用，许多研究表明可通过发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数等形态学指标来表征该植物抗旱性以及施加外源物质后植物对自身抗旱能力的调节作用[21]。黑果枸杞作为耐旱植物，在一定程度的干旱胁迫下能够保持其萌发能力，本研究中轻度干旱下种子萌发各项指标并无明显变化，但在重度干旱下显著下降，这与李佳等[22]研究结果一致。SLs作为根寄生植物种子萌发的信号物质，能够促进这类植物的种子萌发[23]，但对非寄生植物种子萌发的影响未知，在本研究中，低浓度的SLs对黑果枸杞种子萌发有促进作用，通过0.4，1 μmol·L-1SLs浸种的处理组，其发芽率、发芽指数、活力指数高于同干旱不同SLs处理组，即SLs可在一定程度上打破黑果枸杞种子的休眠、增强种子活力，这与庞星月等[24]研究结果相近，其研究发现外源生长调节物质SLs可显著提高干旱胁迫下油菜种子萌发。

SLs作为一种新型植物激素，对植物的影响与脱落酸、生长素、赤霉素等存在交叉集合通路[25]，植物在受干旱胁迫时，生长素、脱落酸等植物激素含量上调[26]，李琬婷等[19]提出脱落酸可通过多种途径如提高植物体内渗透物质含量、增强植物细胞内抗氧化酶活性，以及调节相关抗旱基因表达等来调节植物抗逆性。而王乔健[27]在其研究中发现在逆境胁迫下脱落酸可能参与SLs调控植物对逆境的响应。本研究中无干旱胁迫下施加SLs，黑果枸杞生理指标并无明显变化，说明在未受逆境胁迫时，SLs并不会参与黑果枸杞生理生化反应的调控，猜测可能是在无逆境胁迫时，缺少信号分子使其参与抗逆调控通路。

植物生长和积累干物质主要来源为光合作用，植物在遭受非生物胁迫时可通过改善光合作用来降低光化学损伤[28]；叶绿素是光合作用的基础，叶绿素含量能在一定程度上反映植物利用光能、生产有机物以及适应、利用环境因子的能力[29-30]。干旱胁迫下随着施加SLs浓度的增加，叶绿素含量整体呈先上升后下降趋势，在1 μmol·L-1至5 μmol·L-1时达到峰值，而Wang等[31]提出在干旱胁迫下3 μmol·L-1GR24处理可能有助于防止葡萄叶片叶绿素的降解，对光合作用有积极的影响，说明在本试验中，适宜浓度SLs同样能防止黑果枸杞叶片叶绿素降解。郭有燕等[32]在研究中提出，干旱胁迫下黑果枸杞Chl(a/b)值增加说明此时PSⅡ聚光复合体捕光复合物减少，可减少叶片对光能的捕获，使光合机构免遭光氧化的破坏，是黑果枸杞在受到干旱胁迫时的自我保护策略，本研究中轻度干旱时施加低浓度SLs，Chl(a/b)增加说明SLs可增强黑果枸杞光合作用系统在干旱时的自我保护作用，以增强黑果枸杞抵御干旱的能力。

植物体在受到逆境胁迫时会诱导渗透调节基因表达，产生渗透调节物质如脯氨酸，在渗透调节中起重要作用，干旱胁迫下植物会积累大量脯氨酸，这是植物在受干旱胁迫时作出的生理响应[33]。本研究中干旱胁迫越大Pro含量越高，施加SLs后可提高干旱下Pro含量，且在重度干旱时施加1 μmol·L-1达到峰值，说明SLs可促进干旱下黑果枸杞体内Pro的合成，从而增强黑果枸杞吸收水分的能力以抵御干旱。干旱胁迫是氧化胁迫中的一种，植物产生过量活性氧导致活性氧产生与清除的平衡失调，对植物产生伤害[34]，如膜脂的过氧化反应，MDA是植物细胞膜脂过氧化的最终产物，其含量反映植物受伤害的程度[35]。本研究中在轻度干旱胁迫下施加低浓度SLs，MDA含量有所下降，说明SLs可在一定程度上降低黑果枸杞细胞膜脂过氧化程度，抑制MDA的合成，这与魏如月等[36]研究结果一致。与此同时，植物体内也存在抗氧化系统清除氧自由基，抗氧化系统可分为抗氧化酶系统与抗氧化剂系统[37]，T-AOC可以用于衡量植物抗氧化系统能力的变化。本研究中干旱胁迫下T-AOC增强，在施加SLs后T-AOC上升幅度增大，说明SLs可提高黑果枸杞抗氧化能力抵御干旱，这与万林等[38]研究中发现外源施加SLs可通过增强超氧化物歧化酶、过氧化物酶等抗氧化酶活性以及增加抗坏血酸和谷胱甘肽等抗氧化物含量来降低植物体内活性氧水平一致，但在本研究中SLs具体影响哪些抗氧化酶或抗氧化物还未知，需进行进一步试验。

低浓度植物激素对植物生长有促进效应，高浓度植物激素存在一定的抑制作用[39]，SLs也存在类似效应，本研究中低浓度SLs处理后干旱胁迫下种子的萌发、叶片的叶绿素含量、脯氨酸含量上升，高浓度SLs处理组下降，说明低浓度SLs可提高黑果枸杞抗旱能力从而促进植物生长，高浓度SLs对黑果枸杞的生长有一定抑制作用。

4 结论

1 μmol·L-1外源独脚金内酯浸种后使干旱胁迫下黑果枸杞种子的发芽率、发芽指数、活力指数达到峰值，低浓度即0.18，0.4，1 μmol·L-1外源独脚金内酯对种子的萌发均有一定促进效果，高浓度即10 μmol·L-1外源独脚金内酯处理降低干旱胁迫下种子的发芽率、发芽势，具有一定抑制效果；0.18，0.4，1 μmol·L-1外源独脚金内酯灌施幼苗后能通过提高叶绿素含量、游离脯氨酸含量以及提高抗氧化能力来缓解干旱胁迫对黑果枸杞幼苗的伤害，提高其抗旱性，且以1 μmol·L-1处理效果最佳。