长期服用人工栽培富硒蛹虫草的安全性评价研究

于凯雯，刘沐欣，王升厚，王 泽*

（ 1.沈阳师范大学生命科学学院，辽宁 沈阳 110034 ； 2.沈阳师范大学实验教学中心，辽宁 沈阳 110034 ）

蛹虫草[Cordyceps militaris(L.) Link]是蛹虫草菌子座与菌核的复合体，属于子囊菌门（Ascomycetes）、麦角菌科（Clavicipitaceae）、虫草属（Cordyceps）[1]。蛹虫草不仅作为食品受众广泛，在药用领域也具有举足轻重的地位和作用[2-3]。目前，随着市场需求增多和相关研究不断深入，蛹虫草人工栽培技术愈发完善和成熟[4-5]。蛹虫草的生物活性成分含量与菌种选育[6]、栽培基质和培养方式[7-8]等息息相关。如以柞蚕蛹为栽培基质的蛹虫草，其多糖和蛋白质含量高于小麦和大米为栽培基质的蛹虫草[9]；麦粒培养基获得的蛹虫草子实体核苷含量显著高于大米米基栽培方式[10]。因此，市场流通中的蛹虫草的生物活性成分含量存在显著差异。前期急性试验结果显示，富硒蛹虫草组小鼠出现了肝脏脏器指数偏大、谷丙转氨酶活性下降等异常状况[11]。基于此，本试验旨在通过亚慢性试验和30 d喂养试验，对富硒蛹虫草的食用安全性进行进一步验证。

1 材料与方法

1.1 试验材料

普通蛹虫草及富硒蛹虫草子实体样品均由沈阳师范大学功能性蛹虫草省重点实验室栽培提供。

SPF昆明系级小白鼠，18~22 g，雌雄均有，购自辽宁长生生物技术有限公司。小鼠于动物房中饲养，饲养条件：温度（24±2）℃、湿度50%~60%。

1.2 试剂与仪器

小鼠谷丙转氨酶（ALT）试剂盒、谷草转氨酶（AST）试剂盒、白蛋白（ALB）试剂盒、尿素氮（BUN）试剂盒、肌酐（CREA）试剂盒及胆固醇（TC）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

5424-R高速冷冻离心机（艾本德股份公司）、9PT-3502Q酶标分析仪（北京市普天新桥技术有限公司）、BX-50系统显微镜（OLYMPUS公司）、石蜡切片机（上海青钢包装机械有限公司）、CS-Ⅲ高纯水发生仪（滕州市经纬分析仪器有限责任公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 蛹虫草喷雾粉制备

普通蛹虫草及富硒蛹虫草真空干燥后，机器粉碎，过80目筛，去离子水溶解，55 ℃旋蒸浸提2 h，4 000 r/min离心10 min，过滤后喷雾干燥制备喷雾粉，4 ℃密封储存，配制成水溶液使用。

1.3.2 试验设计

依据中华人民共和国卫生部公告，蛹虫草正常成人推荐使用量为2 g/60 kg·bw，根据Meeh-Rubner公式计算得出小鼠基础使用剂量为12.1 mg/20 g·bw。

1.3.2.1 亚慢性试验

亚慢性试验共设置3组，每组10只小鼠。两个试验组小鼠分别灌胃基础使用剂量的富硒蛹虫草（FX组）及普通蛹虫草（PT组），容量为0.5 mL/只；空白对照组（CK组）小鼠灌胃等量蒸馏水。试验期60 d。

1.3.2.2 30 d喂养试验

30 d喂养试验设置7组，每组10只小鼠。6个试验组小鼠分别灌胃3倍、10倍和30倍基础使用剂量的富硒蛹虫草（FX组）及普通蛹虫草（PT组），用量为0.5 mL/只；空白对照组（CK组）小鼠灌胃等量蒸馏水，连续记录小鼠的生存状态。试验期30 d。

1.3.3 测定指标及方法

1.3.3.1 组织病理学检查

灌胃结束24 h后，所有小鼠处死，解剖并称取肝脏、脾脏、胸腺、肾脏、胃及睾丸重量，计算脏器指数。

脏器指数=脏器重量/体重×100% （1）

采集各组小鼠肝脏、肾脏、胃及小肠组织，4%多聚甲醛固定，4 ℃保存过夜。乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，7 μm厚度切片，苏木精-伊红染色，随机选取20个视野观察记录。

1.3.3.2 肝脏、肾脏基础功能检测

灌胃结束后，所有小鼠眼球取血，室温静置2 h，4 ℃、5 000 r/min离心5 min，取血清-80 ℃储存。根据试剂盒提供的操作步骤进行定量检测。其中ALT采用赖氏法测定；AST采用微板法测定，检测波长为510 nm；ALB采用溴甲酚绿法测定，检测波长为628/630 nm；BUN采用脲酶法测定，检测波长为640 nm；CREA采用肌氨酸氧化酶法测定，检测波长为546 nm；TC采用单试剂GPO-PAP法测定，检测波长为510 nm。

1.4 数据统计及分析

试验数据采用SPSS 20.0软件进行显著性分析，采用单因素方差分析及t检验进行组间比较。结果以“平均值±标准差”表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 亚慢性试验结果（见图1、图2、表1）

亚慢性试验结束后，各组小鼠活动正常，被毛有光泽，粪便良好，未出现死亡案例。

由图1可知，FX组小鼠的肝脏指数和胃指数显著高于CK组（P<0.05），其他脏器差异不显著（P>0.05）。

图1 亚慢性试验小鼠脏器指数结果Fig.1 Results of organ index in subchronic mice

由图2可知，各组小鼠肝脏、肾脏、胃、肠组织均未见病理学结构改变。

图2 亚慢性试验小鼠脏器HE染色结果（×400）Fig.2 HE staining results of organs in subchronic mice (×400)

由表1可知，各组小鼠肝功能、肾功能基础性血清生化指标差异均不显著（P>0.05）。

表1 亚慢性试验小鼠肝脏、肾脏基础功能指标检测结果Tab.1 Detection results of basic function indexes of liver and kidney in subchronic mice

2.2 30 d喂养试验结果（见图3、图4、表2）

30 d喂养试验期间，30倍剂量FX组小鼠出现拒绝饮食饮水、腹泻、身体佝偻、全身颤抖、被毛粗乱稀疏且偏黄、精神不振等不良状态，并于灌胃7 d内全部死亡，其他各组无死亡案例。因此，30 d喂养试验结果仅有CK组、3个剂量PT组以及3倍、10倍FX组。

由图3可知，与CK组相比，各剂量PT组小鼠肾脏指数均显著降低（P<0.05），30倍剂量PT组小鼠胃脏指数显著降低明显（P<0.05），3倍剂量及10倍剂量FX组小鼠肾脏指数显著降低（P<0.05）。

图3 30 d喂养试验小鼠脏器指数结果Fig.3 Results of organ index of mice in 30 days feeding test

由图4可知，各组小鼠脏器组织结构清晰，细胞完整，未见瘀血、水肿、坏死或炎症细胞浸润等组织学改变。

图4 30 d喂养试验小鼠脏器HE染色结果（×400）Fig.4 HE staining results of organs of mice in 30 days feeding test (×400)

由表2可知，与CK组相比，30倍剂量PT组小鼠血清ALT活性及TC含量显著降低（P<0.05），CREA含量显著升高（P<0.05）；10倍剂量FX组小鼠血清TC含量显著降低（P<0.05），CREA含量显著升高（P<0.05）。与CK组相比，PT组及FX组小鼠血清AST活性及ALB、BUN的含量差异 均不显著（P>0.05）。

表2 30 d喂养试验小鼠肝脏、肾脏基础功能指标检测结果Tab.2 Detection results of basic function indexes of liver and kidney of 30 day feeding test

3 讨论

亚慢性试验通过较长期的动物试验确定受试物的安全性，为慢性试验摸索适宜的接触剂量。本研究中，亚慢性试验结果显示，各组小鼠大体解剖、病理切片结果及血清生化指标差异均不显著，表明较长时间摄入推荐剂量的两种虫草均未对小鼠产生亚慢性毒性。

30 d喂养试验可初步获得受试物造成机体损伤的剂量范围，从而确定受试物的食用安全性及范围。有研究表明，当小鼠的硒摄入量为0.06~0.99 μg/g时，会出现不同程度的硒中毒现象[12]。本试验中，30倍剂量FX组小鼠出现拒食、腹泻、身体佝偻、全身颤抖、被毛粗乱稀疏且偏黄等不良生长状况，并在7 d内全部死亡，由此推测30倍剂量FX组小鼠存在硒中毒倾向。机体血清TC含量的降低与肝脏功能异常具有一定相关性，当出现肝炎、肝硬化等肝功能障碍时，血清TC含量会降低[13]。CREA是衡量肾功能的主要指标，其含量增高表示肾功能出现损伤，甚至衰竭，故可作为早期肾病诊断的标准之一[14-15]。本试验中，30倍剂量PT组和10倍剂量FX组小鼠出现血清TC含量降低及CREA含量显著升高的状况，推测30倍剂量普通蛹虫草和10倍剂量富硒蛹虫草对小鼠机体的肝脏和肾脏代谢功能产生了较明显的损害。

4 结论

综上所述，普通蛹虫草和富硒蛹虫草均建议按照推荐剂量使用，同时较长时期连续摄入两种虫草均具有良好的食用安全性。为更完整地评价两种虫草的使用安全性，后续应进行慢性毒理性试验加以深入佐证。